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As proteínas ferro-enxofre (Fe-S), essenciais para todas as formas de vida, são difíceis de sintetizar devido à complicada maquinaria molecular envolvida e à sensibilidade dos aglomerados de Fe-S ao oxigênio. Num novo estudo, uma equipa de investigadores desenvolveu um protocolo inovador para a síntese de proteínas Fe-S maduras, reunindo um sistema de assimilação de enxofre recombinante (SUF) e um sistema de eliminação de oxigénio, abrindo assim caminho para novas tecnologias e uma melhor compreensão da evolução da vida.
Os aglomerados de Fe-S, que fazem parte das proteínas Fe-S, são encontrados em todas as formas de vida. Eles desempenham um papel significativo como cofatores biológicos – moléculas auxiliares que auxiliam essas proteínas em diferentes transformações bioquímicas – que estão envolvidas na respiração e no metabolismo. Esses clusters são de grande interesse de pesquisa, uma vez que são considerados uma parte crítica da evolução. Eles servem como um elo entre a química pré-biótica (processos químicos que existiam antes do surgimento das formas de vida) e os complexos sistemas moleculares e biológicos que conhecemos hoje. Simplificando, podem ser um dos catalisadores primitivos que levaram ao surgimento da vida na Terra. Assim, ter métodos convenientes para sintetizar proteínas Fe-S irá, esperançosamente, avançar a nossa compreensão da biologia da Terra jovem e ajudar-nos a responder à questão final da origem da vida.
No entanto, apesar da sua prevalência, a síntese de proteínas Fe-S maduras fora da célula tem provado ser um desafio. Eles não apenas requerem maquinaria celular complexa para síntese, mas também se degradam facilmente em contato com o oxigênio devido à sua reação com seus aglomerados de Fe-S. Portanto, os cientistas foram forçados a seguir o caminho complicado de primeiro produzir e extrair uma proteína incompleta (ou ‘apo’), seguida pela sua maturação (adição do cofator Fe-S) sob condições estritamente privadas de oxigênio. Mas o que torna este processo ainda mais difícil é a presença de proteínas contaminantes contendo ferro no extrato final.
Em um estudo recente, uma equipe de pesquisadores, incluindo os professores associados Kosuke Fujishima e Shawn McGlynn do Earth-Life Science Institute (ELSI), Instituto de Tecnologia de Tóquio e o professor assistente Po-Hsiang Wang da National Central University desenvolveram um novo protocolo para produzindo maduro [4Fe-4S] proteínas nas quais o aglomerado Fe-S é colocado dentro de uma estrutura semelhante a um cubo. A equipe desenvolveu uma via especializada do sistema de proteínas de montagem Fe-S que funcionaria em um ambiente livre de oxigênio devido à presença de um sistema de eliminação de oxigênio para fornecer proteínas Fe-S maduras.
Os pesquisadores primeiro procuraram montar o que é conhecido como sistema de formação de enxofre (SUF). Nas bactérias, este sistema multiproteico contém todo o maquinário necessário para produzir [4Fe-4S] aglomerados. Possui maior tolerância ao oxigênio quando comparado a outras vias com funções semelhantes (como fixação de nitrogênio e sistema de cluster em enxofre). A equipe de pesquisa criou uma via SUF recombinante que consiste em seis subunidades proteicas com capacidade de funcionar em um ambiente livre de células.
Para manter um ambiente livre de oxigênio dentro do tubo de ensaio, os pesquisadores introduziram então uma cascata de três enzimas (um conjunto de três reações enzimáticas que ocorrem em sequência) que serve como um sistema de eliminação de oxigênio. Embora este sistema de eliminação remova o oxigênio do meio ambiente, ele também melhora a eficiência do sistema. Ele consegue isso produzindo dinucleotídeo de flavina adenina reduzido (FADH2), um transportador de elétrons necessário para a síntese do cluster Fe-S pelo sistema SUF.
Finalmente, para a síntese da proteína apo, a equipe adotou um método especializado livre de células que permite a em vitro produção de proteínas usando a síntese de proteínas reconstituídas livres de células, conhecida como sistema PURE. Com a adição de material genético (DNA ou mRNA) e das fontes de energia necessárias, o sistema PURE atua essencialmente como uma fábrica artificial de proteínas.
Assim, os pesquisadores combinaram o sistema PURE, o O2– cascata de enzimas eliminadoras e os componentes da via SUF em um único tubo para realizar a síntese livre de células em um único recipiente de dois representantes [4Fe-4S] proteínas: aconitase e ferredoxina termofílica. Explicando os processos iterativos experimentados para encaixar as peças do quebra-cabeça, um co-autor, estudante de doutorado, Shota Nishikawa, comenta: “foi um desafio chegar à estequiometria apropriada e à concentração de substrato/cofator. No entanto, realizamos um trabalho completo estudos para caracterizar a proporção adequada de enzimas necessárias no sistema PURE.”
O protocolo desenvolvido neste estudo tem implicações significativas para a comunidade científica. “Criamos um método novo e conveniente para a síntese de proteínas Fe-S maduras que não requer mais um porta-luvas volumoso”, destaca Fujishima. Ele afirma que o seu protocolo supera os desafios tradicionais do [4Fe-4S] montagem de cluster e O2 sensibilidade, que têm sido grandes obstáculos nos campos da biologia sintética e da enzimologia anaeróbica. Ao ampliar significativamente as capacidades do sistema PURE, a estratégia proposta pelos investigadores poderá levar ao desenvolvimento de novas biotecnologias e a uma melhor compreensão dos fundamentos da síntese e montagem de proteínas.
De olho no futuro, os pesquisadores observam que este trabalho abre diversas portas para estudos futuros. Ser capaz de implementar em vitro ambientes livres de oxigênio poderiam ajudar os cientistas a replicar outros tipos de vias multiproteicas, como as vias de fixação de nitrogênio (NIF) e aglomerado de ferro-enxofre (ISC), para sintetizar outras enzimas portadoras de cofatores metálicos. Isto, por sua vez, pode levar ao desenvolvimento de novos biocatalisadores e células sintéticas, com aplicações potenciais na remediação ambiental, produção de energia, medicina e astrobiologia.
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