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CRISPR, a tecnologia de edição de genes vencedora do Prêmio Nobel, está prestes a ter um impacto profundo nos campos da microbiologia e da medicina mais uma vez.
Uma equipe liderada pela pioneira do CRISPR, Jennifer Doudna, e sua colaboradora de longa data, Jill Banfield, desenvolveram uma ferramenta inteligente para editar os genomas de vírus que infectam bactérias, chamados bacteriófagos, usando uma forma rara de CRISPR. A capacidade de projetar facilmente fagos personalizados – que há muito ilude a comunidade de pesquisa – pode ajudar os pesquisadores a controlar microbiomas sem antibióticos ou produtos químicos agressivos e tratar infecções perigosas resistentes a medicamentos. Um artigo descrevendo o trabalho foi publicado recentemente na Natureza Microbiologia.
“Os bacteriófagos são algumas das entidades biológicas mais abundantes e diversas da Terra. Ao contrário das abordagens anteriores, essa estratégia de edição funciona contra a tremenda diversidade genética dos bacteriófagos”, disse o primeiro autor Benjamin Adler, pós-doutorado no laboratório de Doudna. “Há tantas direções emocionantes aqui – a descoberta está literalmente ao nosso alcance!”
Os bacteriófagos, também chamados simplesmente de fagos, inserem seu material genético nas células bacterianas usando um aparelho semelhante a uma seringa e, em seguida, sequestram o maquinário de construção de proteínas de seus hospedeiros para se reproduzirem – geralmente matando as bactérias no processo. (Eles são inofensivos para outros organismos, incluindo nós humanos, embora as imagens de microscopia eletrônica tenham revelado que eles se parecem com naves alienígenas sinistras.)
CRISPR-Cas é um tipo de mecanismo de defesa imune que muitas bactérias e archaea usam contra fagos. Um sistema CRISPR-Cas consiste em fragmentos curtos de RNA que são complementares às sequências nos genes do fago, permitindo que o micróbio reconheça quando o material genético invasivo foi inserido e enzimas semelhantes a tesouras que neutralizam os genes do fago, cortando-os em pedaços inofensivos, depois de ser guiado para o lugar pelo RNA.
Ao longo de milênios, a batalha evolutiva perpétua entre o ataque do fago e a defesa bacteriana forçou os fagos a se especializarem. Existem muitos micróbios, então também existem muitos fagos, cada um com adaptações únicas. Essa diversidade surpreendente dificultou a edição de fagos, inclusive tornando-os resistentes a muitas formas de CRISPR, e é por isso que o sistema mais usado – CRISPR-Cas9 – não funciona para este aplicativo.
“Os fagos têm muitas maneiras de escapar das defesas, desde anti-CRISPRs até apenas serem bons em reparar seu próprio DNA”, disse Adler. “Então, de certa forma, as adaptações codificadas nos genomas dos fagos que os tornam tão bons na manipulação de micróbios são exatamente a mesma razão pela qual tem sido tão difícil desenvolver uma ferramenta de uso geral para editar seus genomas”.
Os líderes do projeto, Doudna e Banfield, desenvolveram várias ferramentas baseadas em CRISPR juntos desde que colaboraram pela primeira vez em uma investigação inicial do CRISPR em 2008. Esse trabalho – realizado no Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) – foi citado pelo comitê do Prêmio Nobel quando Doudna e sua outra colaboradora, Emmanuelle Charpentier, receberam o prêmio em 2020. Doudna e a equipe de Banfield do Berkeley Lab e pesquisadores da UC Berkeley estavam estudando as propriedades de uma forma rara de CRISPR chamada CRISPR-Cas13 (derivada de uma bactéria comumente encontrada no ser humano boca) quando descobriram que esta versão do sistema de defesa funciona contra uma enorme variedade de fagos.
A potência de combate ao fago do CRISPR-Cas13 foi inesperada, dado que poucos micróbios o usam, explicou Adler. Os cientistas ficaram duplamente surpresos porque todos os fagos derrotados nos testes infectam usando DNA de fita dupla, mas o sistema CRISPR-Cas13 visa e corta apenas o RNA viral de fita simples. Como outros tipos de vírus, alguns fagos têm genomas baseados em DNA e alguns têm genomas baseados em RNA. No entanto, todos os vírus conhecidos usam RNA para expressar seus genes. O sistema CRISPR-Cas13 neutralizou efetivamente nove fagos de DNA diferentes que infectam cepas de E. coli, ainda não têm quase nenhuma semelhança em seus genomas.
De acordo com o co-autor e especialista em fagos Vivek Mutalik, um cientista da equipe da Área de Biociências do Berkeley Lab, essas descobertas indicam que o sistema CRISPR pode se defender contra diversos fagos baseados em DNA, visando seu RNA depois de ter sido convertido do DNA pela própria bactéria. enzimas antes da tradução de proteínas.
Em seguida, a equipe demonstrou que o sistema pode ser usado para editar genomas de fagos, em vez de apenas cortá-los defensivamente.
Primeiro, eles fizeram segmentos de DNA compostos pela sequência de fagos que queriam criar flanqueados por sequências de fagos nativos e os colocaram na bactéria alvo do fago. Quando os fagos infectaram os micróbios carregados de DNA, uma pequena porcentagem dos fagos se reproduzindo dentro dos micróbios pegou o DNA alterado e o incorporou em seus genomas no lugar da sequência original. Esta etapa é uma técnica de edição de DNA de longa data chamada recombinação homóloga. O problema de décadas na pesquisa de fagos é que, embora esta etapa, a edição real do genoma do fago, funcione muito bem, isolar e replicar os fagos com a sequência editada do conjunto maior de fagos normais é muito complicado.
É aqui que entra o CRISPR-Cas13. Na etapa dois, os cientistas projetaram outra cepa do micróbio hospedeiro para conter um sistema CRISPR-Cas13 que detecta e defende contra a sequência normal do genoma do fago. Quando os fagos feitos na etapa um foram expostos aos hospedeiros de segunda rodada, os fagos com a sequência original foram derrotados pelo sistema de defesa CRISPR, mas o pequeno número de fagos editados foi capaz de evitá-lo. Eles sobreviveram e se replicaram.
Experimentos com três não relacionados E. coli os fagos mostraram uma taxa de sucesso impressionante: mais de 99% dos fagos produzidos nos processos de duas etapas continham as edições, que variavam de enormes exclusões de vários genes até substituições precisas de um único aminoácido.
“Na minha opinião, este trabalho em engenharia de fagos é um dos principais marcos na biologia de fagos”, disse Mutalik. “Como os fagos afetam a ecologia microbiana, a evolução, a dinâmica populacional e a virulência, a engenharia perfeita de bactérias e seus fagos tem profundas implicações para a ciência fundamental, mas também tem o potencial de fazer uma diferença real em todos os aspectos da bioeconomia. saúde, essa capacidade de engenharia de fagos afetará tudo, desde a biomanufatura e agricultura até a produção de alimentos”.
Estimulados por seus resultados iniciais, os cientistas estão atualmente trabalhando para expandir o sistema CRISPR para usá-lo em mais tipos de fagos, começando com aqueles que afetam as comunidades microbianas do solo. Eles também o estão usando como uma ferramenta para explorar os mistérios genéticos dos genomas dos fagos. Quem sabe que outras ferramentas e tecnologias incríveis podem ser inspiradas pelos despojos da guerra microscópica entre bactérias e vírus?
Esta pesquisa foi financiada pela Área de Foco Científico do Departamento de Análise de Comunidade Microbiana de Energia e Avaliação Funcional em Solos (m-CAFES). Jill Banfield é professora de Ciências da Terra e Planetárias e Ciências, Políticas e Gestão Ambientais na UC Berkeley, bem como cientista do corpo docente na Área de Biociências do Berkeley Lab e afiliada na Área de Ciências da Terra e Ambientais. Jennifer Doudna é professora nos departamentos de Biologia Molecular e Celular e Química da UC Berkeley e cientista do corpo docente na Área de Biociências do Berkeley Lab.
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