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Um estudo histórico realizado por pesquisadores do SLAC National Accelerator Laboratory do Departamento de Energia e da Universidade de Stanford revela como uma pequena máquina celular chamada TRiC direciona o dobramento da tubulina, uma proteína humana que é o bloco de construção dos microtúbulos que servem como andaime da célula e sistema de transporte .
Até agora, os cientistas pensavam que o TRiC e máquinas semelhantes, conhecidas como chaperoninas, forneciam passivamente um ambiente propício à dobra, mas não participavam diretamente dela.
Até 10% das proteínas em nossas células, bem como nas plantas e animais, recebem ajuda prática dessas pequenas câmaras para se dobrar em suas formas ativas finais, estimaram os pesquisadores.
Muitas das proteínas que se dobram com a ajuda do TRiC estão intimamente ligadas a doenças humanas, incluindo certos tipos de câncer e distúrbios neurodegenerativos como as doenças de Parkinson, Huntington e Alzheimer, disse a professora de Stanford Judith Frydman, uma das principais autoras do estudo.
Na verdade, disse ela, muitas drogas anticancerígenas são projetadas para interromper a tubulina e os microtúbulos que ela forma, que são realmente importantes para a divisão celular. Portanto, direcionar o processo de dobramento de tubulina assistido por TRiC pode fornecer uma estratégia anticancerígena atraente.
A equipe relatou os resultados de seu estudo de uma década em um artigo publicado na Célula hoje.
“Esta é a estrutura de proteína mais interessante em que trabalhei em meus 40 anos de carreira”, disse Wah Chiu, professor do SLAC/Stanford, pioneiro no desenvolvimento e uso de microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM) e diretor do SLAC’s cryo-EM e divisão de bioimagem.
“Quando conheci Judith, 20 anos atrás”, disse ele, “conversamos sobre se poderíamos ver proteínas se dobrando. Isso é algo que as pessoas vêm tentando fazer há anos e agora conseguimos.”
Os pesquisadores capturaram quatro etapas distintas no processo de dobramento direcionado por TRiC em resolução quase atômica com crio-EM e confirmaram o que viram com análises bioquímicas e biofísicas.
No nível mais básico, disse Frydman, este estudo resolve o enigma de longa data de por que a tubulina não pode se dobrar sem a ajuda do TRiC: “É realmente uma virada de jogo ao finalmente trazer uma nova maneira de entender como as proteínas se dobram na célula humana”.
Dobrando espaguete em flores
As proteínas desempenham papéis essenciais em praticamente tudo o que uma célula faz, e descobrir como elas se dobram em seus estados 3D finais é uma das missões mais importantes da química e da biologia.
Como Chiu coloca, “Uma proteína começa como uma cadeia de aminoácidos que se parece com espaguete, mas não pode funcionar até que seja dobrada em uma flor com o formato certo”.
Desde meados da década de 1950, nossa imagem de como as proteínas se dobram foi moldada por experimentos feitos com pequenas proteínas pelo pesquisador do National Institutes of Health, Christian Anfinsen. Ele descobriu que, se desdobrasse uma pequena proteína, ela retornaria espontaneamente à mesma forma e concluiu que as instruções para fazer isso estavam codificadas na sequência de aminoácidos da proteína. Anfinsen compartilhou o Prêmio Nobel de Química de 1972 por esta descoberta.
Trinta anos depois, os pesquisadores descobriram que máquinas celulares especializadas ajudam a dobrar as proteínas. Mas a visão predominante era que sua função se limitava a ajudar as proteínas a realizar seu dobramento espontâneo, protegendo-as de ficarem presas ou se aglomerarem.
Um tipo de máquina auxiliar, chamada de chaperonina, contém uma câmara semelhante a um barril que retém as proteínas enquanto elas se dobram. TRiC se encaixa nesta categoria.
A câmara TRiC é única porque consiste em oito subunidades diferentes que formam dois anéis empilhados. Um fio longo e fino de proteína tubulina é entregue na abertura da câmara por uma molécula auxiliar em forma de água-viva. Então a tampa da câmara se fecha e a dobragem começa. Quando terminar, a tampa se abre e a tubulina dobrada acabada sai.
Como a tubulina não pode se dobrar sem o TRiC, parece que o TRiC pode fazer mais do que ajudar passivamente a tubulina a se dobrar espontaneamente. Mas como, exatamente, é que isso funciona? Este novo estudo responde a essa pergunta e demonstra que, pelo menos para proteínas como a tubulina, o conceito de “dobramento espontâneo” não se aplica. Em vez disso, o TRiC orquestra diretamente a via de dobramento que leva à proteína com formato correto.
Embora os avanços recentes em inteligência artificial, ou IA, possam prever a estrutura dobrada e acabada da maioria das proteínas, disse Frydman, a IA não mostra como uma proteína atinge sua forma correta. Esse conhecimento é fundamental para controlar o dobramento da célula e desenvolver terapias para doenças do dobramento. Para atingir esse objetivo, os pesquisadores precisam descobrir as etapas detalhadas do processo de dobramento conforme ele ocorre na célula.
Uma câmara celular assume o comando
Dez anos atrás, Frydman, Chiu e suas equipes de pesquisa decidiram se aprofundar no que acontece na câmara TRIC.
“Comparado com as câmaras de dobramento mais simples de chaperoninas em bactérias, o TRiC em células humanas é uma máquina muito interessante e complicada”, disse Frydman. “Cada uma de suas oito subunidades tem propriedades diferentes e apresenta uma superfície distinta dentro da câmara, e isso acaba sendo muito importante.”
Os cientistas descobriram que o interior desta câmara única direciona o processo de dobra de duas maneiras.
À medida que a tampa da câmara se fecha sobre uma proteína, áreas de carga eletrostática aparecem em suas paredes internas. Eles atraem partes com cargas opostas da fita de proteína tubulina e essencialmente as prendem à parede para criar a forma e a configuração adequadas para a próxima etapa da dobragem. Enquanto isso, as “caudas” da subunidade TRiC que pendem da parede da câmara agarram a proteína tubulina em momentos e locais específicos para ancorá-la e estabilizá-la.
Para começar, uma extremidade do fio de tubulina se prende a um pequeno bolso na parede. Em seguida, a outra extremidade é presa em um local diferente e dobrada. Agora, a ponta que se enganchou na parede se dobra de uma forma que a traz bem ao lado da primeira área dobrada.
Na etapa três, parte da seção do meio se dobra para formar o núcleo da proteína, juntamente com bolsos onde o GTP, uma molécula que armazena e libera energia para alimentar o trabalho da célula, pode se conectar.
Finalmente, a seção de proteína restante se dobra. A molécula de tubulina agora está pronta para ação.
“Esses instantâneos estruturais de estágios intermediários na sequência de dobramento nunca foram vistos antes pela microscopia crioeletrônica”, disse Frydman.
Uma poderosa combinação de técnicas
Sua equipe confirmou a sequência de dobramento com uma série desafiadora de testes bioquímicos e biofísicos que exigiram anos de trabalho.
A interpretação desses resultados permitiu que os pesquisadores construíssem uma imagem da mudança de forma da tubulina à medida que ela se dobrava dentro da câmara TRiC, que combinava com as imagens geradas pelo cryo-EM.
“É muito poderoso ser capaz de ir e voltar entre essas técnicas, porque então você pode realmente saber que o que você vê reflete o que está acontecendo na célula”, disse Frydman.
“A ciência nos surpreendeu com uma solução realmente interessante que eu não teria previsto.”
O estudo também oferece pistas para entender como esse sistema de dobramento evoluiu em células eucarióticas, que compõem plantas, animais e humanos, mas não em células mais simples como as de bactérias e archaea. À medida que as proteínas se tornaram cada vez mais complexas para atender às necessidades das células eucarióticas, sugerem os pesquisadores, em algum momento elas não conseguiram se dobrar nas formas necessárias para realizar trabalhos mais complicados sem uma pequena ajuda. Proteínas eucarióticas e sua câmara de chaperonina provavelmente evoluíram juntas, possivelmente começando com o último ancestral comum de todos os organismos eucarióticos há cerca de 2,7 bilhões de anos.
Devido à complexidade das análises e ao interlúdio da pandemia, o estudo se estendeu por tanto tempo que muitas das pessoas que nele trabalharam mudaram para outros empregos. Eles incluem os pesquisadores de pós-doutorado Daniel Gestaut e Miranda Collier do grupo de Frydman, que realizaram a parte bioquímica do projeto e o impulsionaram, e Yanyan Zhao, Soung-Hun Roh, Boxue Ma e Greg Pintilie do grupo de Chiu, que realizaram a crio -Análise EM. Colaboradores adicionais incluíram Junsun Park, um aluno do grupo de Roh, e Alexander Leitner da ETH em Zurique, Suíça.
O trabalho foi apoiado por bolsas para Wah Chiu e Judith Frydman do NIH e bolsas para Soung-Hun Roh, que agora é professor assistente na Universidade Nacional de Seul, da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia e da Fundação Suh Kyungbae (SUHF).
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