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Uma equipe de pesquisadores desenvolveu uma ferramenta de software chamada análise DANGER (Deleterious and ANticipatable Guides Evaluated by RNA-sequencing) que fornece uma maneira para o design mais seguro da edição do genoma em todos os organismos com um transcriptoma. Por cerca de uma década, os pesquisadores usaram a tecnologia CRISPR para edição do genoma. No entanto, existem alguns desafios no uso do CRISPR. A análise DANGER supera esses desafios e permite que os pesquisadores realizem avaliações mais seguras dentro e fora do alvo, sem um genoma de referência. Ele possui potencial para aplicações em medicina, agricultura e pesquisa biológica.
Seu trabalho é publicado na revista Avanços em Bioinformática em 23 de agosto de 2023.
A edição do genoma, ou edição de genes, refere-se a tecnologias que permitem aos pesquisadores alterar o DNA genômico de um organismo. Com estas tecnologias, os investigadores podem adicionar, remover ou alterar material genético no genoma.
CRISPR-Cas9 é uma tecnologia de edição genética bem conhecida. Tem a reputação de ser mais preciso, mais rápido e mais barato do que outras tecnologias semelhantes. No entanto, a edição genética utilizando a tecnologia CRISPR apresenta alguns desafios. O primeiro desafio é que os efeitos fenotípicos, ou observáveis, causados pela dinâmica inesperada do CRISPR não são monitorados quantitativamente.
Um segundo desafio é que a tecnologia CRISPR depende geralmente de dados genómicos básicos, incluindo o genoma de referência. O genoma de referência é como um modelo que fornece aos pesquisadores informações gerais sobre o genoma. Pode ocorrer edição de sequência inesperada com incompatibilidades. Esses sites fora do alvo são sempre inesperados. Portanto, os pesquisadores precisam de uma maneira de observar sequências genômicas factuais e limitar potenciais efeitos fora do alvo. “O projeto da edição do genoma requer uma sequência genômica bem caracterizada. No entanto, a informação genômica de pacientes, cânceres e organismos não caracterizados é muitas vezes incompleta”, disse Kazuki Nakamae, professor assistente do Laboratório de Pesquisa Colaborativa PtBio no Genome Editing Innovation. Centro, Universidade de Hiroshima.
A equipe de pesquisa decidiu desenvolver um método para lidar com as questões dos efeitos fenotípicos e da dependência de um genoma de referência. O software de análise DANGER da equipe supera esses desafios. A equipe usou amostras editadas por genes de células humanas e cérebros de peixes-zebra para conduzir sua avaliação de aversão ao risco dentro e fora do alvo em dados de sequenciamento de RNA.
A equipe demonstrou que o pipeline de análise DANGER atinge vários objetivos. Ele detectou potenciais locais de DNA dentro e fora do alvo na região transcrita de mRNA no genoma usando dados de sequenciamento de RNA. Ele avaliou os efeitos fenotípicos de locais deletérios fora do alvo com base nas evidências fornecidas pelas alterações na expressão gênica. Quantificou o risco fenotípico no nível do termo da ontologia genética, sem um genoma de referência. Este sucesso mostrou que a análise DANGER pode ser realizada em vários organismos, genomas humanos pessoais e genomas atípicos criados por doenças e vírus.
O pipeline de análise DANGER identifica os locais genômicos dentro e fora do alvo com base em de novo montagem do transcriptoma usando dados de sequenciamento de RNA. Um transcriptoma inclui uma coleção de todas as leituras de genes ativos em uma célula. Com de novo montagem do transcriptoma, o transcriptoma é montado sem a ajuda de um genoma de referência. Em seguida, a análise de PERIGO identifica os alvos prejudiciais. Estes são alvos fora das regiões transcritas de mRNA que representam a regulação negativa da expressão em amostras editadas em comparação com as do tipo selvagem. Finalmente, o software quantifica o risco fenotípico usando a ontologia genética dos alvos deletérios. “Nossa análise DANGER é um software novo que permite quantificar efeitos fenotípicos causados por estimativas fora do alvo. Além disso, nossa ferramenta usa de novo montagem de transcriptoma cujas sequências podem ser construídas a partir de dados de sequenciamento de RNA de amostras tratadas sem um genoma de referência”, disse Hidemasa Bono, professor do Centro de Inovação em Edição de Genoma da Universidade de Hiroshima.
Olhando para o futuro, a equipa espera expandir a sua investigação utilizando a análise DANGER. “Aplicaremos o software a várias amostras de edição do genoma de pacientes e culturas para esclarecer o efeito fenotípico e estabelecer estratégias mais seguras para a edição do genoma”, disse Nakamae.
A análise DANGER é de código aberto e livremente ajustável. Portanto, o algoritmo deste pipeline poderia ser reaproveitado para a análise de vários sistemas de edição de genoma além do sistema CRISPR-Cas9. Também é possível aumentar a especificidade da análise DANGER para CRISPR-Cas9 incorporando algoritmos de pontuação fora do alvo específicos do CRISPR-Cas9. A equipe acredita que o pipeline de análise DANGER expandirá o escopo dos estudos genômicos e aplicações industriais usando a edição do genoma.
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