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Cientistas do St. Jude Children’s Research Hospital anunciaram hoje uma maneira de melhorar as medições de distância em escala molecular usando transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET). smFRET quantifica as propriedades de excitação e emissão de produtos químicos chamados fluoróforos.
Quando um elétron excitado no fluoróforo relaxa, ele emite luz após um atraso, fazendo com que a molécula brilhe (fluoresce). No entanto, os fluoróforos nem sempre apresentam fluorescência após a excitação. Em vez disso, através de processos mecânicos quânticos relacionados ao estado de “spin” do elétron excitado, eles podem entrar em estados escuros triplos de longa duração que não apresentam fluorescência. Isso reduz a sensibilidade e a precisão das medições smFRET. Ao controlar a duração dos estados escuros através de tecnologias de “autocura”, os cientistas da St. Jude mostram agora que os estados escuros triplos podem ser fortemente mitigados. Este avanço aumenta significativamente a resolução do método para avançar no campo da imagem molecular. As descobertas foram publicadas hoje em Métodos da Natureza.
smFRET captura momentos moleculares fugazes
Capturar o bater das asas de um beija-flor requer câmeras especializadas com alta taxa de quadros e iluminação que evite o desfoque do movimento rápido. Visualizar o voo de um beija-flor não é nada comparado aos desafios de capturar as funções das biomoléculas em nosso corpo. As biomoléculas são menores que o comprimento de onda da luz (da ordem de um bilionésimo de polegada) e suas funções estão ligadas ao seu movimento, mudando de posição ou forma (conformação) centenas a milhares de vezes por segundo. Medir estas dinâmicas fugazes é vital para compreender verdadeiramente como as moléculas desempenham as suas funções, como estas funções são perturbadas nas doenças e como as terapias medicamentosas modificam as suas atividades. smFRET, uma técnica de imagem molecular, é uma maneira poderosa de visualizar diretamente como as biomoléculas se movem em tempo real e em escala de molécula única.
Jude, Scott Blanchard, PhD, Departamentos de Biologia Estrutural e Biologia Química e Terapêutica, está avançando no campo da imagem smFRET. Os esforços no laboratório Blanchard, por meio do St. Jude Single-Molecule Imaging Center, têm sido essenciais para o projeto e desenvolvimento de fluoróforos que permitem medições em escala molecular.
“As moléculas fluorescentes mais comuns e amplamente utilizadas geralmente não estão à altura da tarefa de quantificar eventos em escala molecular. Isso nos levou a assumir o desafio de sintetizar nossos próprios fluoróforos”, disse Blanchard. “No processo, percebemos que a fotofísica fundamental da fluorescência precisava ser alterada.”
Para conduzir experimentos smFRET, os pesquisadores colocam fluoróforos em dois pontos de uma biomolécula. Quando um laser é direcionado ao primeiro desses fluoróforos (o doador), um elétron dentro dele ganha essa energia, ficando excitado. Quando o elétron relaxa, essa energia é transferida através do espaço para o segundo fluoróforo (o aceitador), mas somente se estiver próximo do doador. Ao registrar e quantificar explosões fluorescentes de fluoróforos doadores e aceitadores, as distâncias podem ser medidas na ordem de um bilionésimo de polegada. Cada informação é vital para a compreensão da função e do mau funcionamento biológico. No entanto, o uso correto da técnica requer uma navegação cuidadosa das propriedades fundamentais da fluorescência.
O spin flip do elétron trava no estado tripleto
As regras que regem a emissão de luz de um fluoróforo giram em torno do spin do elétron. Quando um elétron excitado relaxa, ele deve voltar ao seu estado original, mantendo seu estado de spin ou número quântico de spin. Isso nem sempre acontece, no entanto.
“Cada vez que um elétron é excitado, há uma probabilidade de que ele perca a memória de seu spin e adote um estado de spin invertido”, disse Blanchard, autor correspondente do artigo. Métodos da Natureza estudar. “Embora este processo seja relativamente raro, com uma probabilidade aproximada de 1 em 100, se ele mudar seu estado de spin, então ele termina neste estado triplo de vida 100.000 vezes mais longa que não fluoresce. Consequentemente, o fluoróforo torna-se muito mais escuro do que caso contrário poderia ser.
“O campo da fluorescência tem lutado contra isso há anos”, acrescentou Blanchard. “No contexto do FRET, notamos que os acúmulos de estado triplo mudam com a intensidade da iluminação e variam para diferentes fluoróforos.”
O FRET exige que os fluoróforos doadores e aceitadores se comportem da mesma maneira. Mas, como a técnica exige a excitação direta de um e não do outro, quando você liga o laser, os estados triplos do doador e do aceitador ficam ocupados em taxas diferentes.
“Você acaba com um processo nauseante, onde o doador e o aceitador se estabilizam em níveis diferentes, então eles estão perdendo desempenho em graus diferentes”, explicou Blanchard. “As leituras experimentais tornam-se variadas, levando a reduções na qualidade e confiabilidade dos dados de imagem. Isso restringe fundamentalmente os limites de resolução espacial e temporal das medições smFRET.”
Um objetivo principal dos estudos de engenharia de fluoróforos é, portanto, reduzir o tempo de vida dos estados tripletos na medida do possível. Este é o objetivo fundamental das tecnologias de “autocura”.
“Para garantir medições precisas de distância em dados smFRET, o campo atualmente depende de etapas de calibração que não consideram explicitamente os estados triplos”, explicou a coautora Zeliha Kilic, PhD, Departamento de Biologia Estrutural de St. “As tecnologias de autocura aproximam o campo das condições ideais onde os estados triplos estão ausentes, garantindo que as etapas de calibração empregadas produzam resultados mais precisos e, portanto, medições de distância.”
Fluoróforos autocurativos guiam o caminho
Produtos químicos chamados de supressores de estado triplo, como o ciclooctatetraeno, neutralizam esse fenômeno, mas também tendem a atrapalhar o trabalho. “O ciclooctatetraeno é gorduroso, apresenta solubilidades variadas e baixas e é difícil de controlar”, disse Blanchard.
Publicações anteriores da equipe de Blanchard relataram o desenvolvimento de fluoróforos com ciclooctatetraeno diretamente ligado. Esta abordagem resolveu o problema de solubilidade e criou fluoróforos de “autocura” nos quais a ocupação do estado tripleto foi reduzida em até 1.000 vezes. No novo estudo, os pesquisadores demonstraram que o uso de fluoróforos autocurativos como doadores e aceitadores em experimentos smFRET melhora a qualidade e a confiabilidade dos dados e evita a perda na qualidade da imagem à medida que a intensidade do laser aumenta. Essas melhorias ampliam as fronteiras do smFRET, e as tecnologias de fluoróforo autocuráveis estão encontrando aplicações cada vez mais diversas em todo o mundo.
“O brilho aprimorado e a fotoestabilidade dos fluoróforos autocurativos tornam possível melhorar dramaticamente a resolução espaço-temporal da imagem smFRET”, disse o co-primeiro autor Avik Pati, PhD, ex-Departamento de Biologia Estrutural de St. Tecnologia e Ciência. “Agora podemos quantificar de forma robusta a dinâmica conformacional em escala nanométrica dentro de biomoléculas únicas em submilissegundos e em concentrações fisiológicas de oxigênio.”
Blanchard está confiante de que essas descobertas ajudarão os pesquisadores da St. Jude e a comunidade científica em geral. “Ampliar as fronteiras das inovações em imagens em St. Jude faz parte do plano estratégico da instituição e estamos confiantes de que os fluoróforos autocurativos desempenharão um papel importante no cumprimento de nossos objetivos”, disse ele. “Além disso, muitos provavelmente se beneficiarão desses avanços, já que a abordagem de autocura mostrou potencial para melhorar a maioria das aplicações de fluorescência.”
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