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Cada célula viva transcreve DNA em RNA. Esse processo começa quando uma enzima chamada RNA polimerase (RNAP) se prende ao DNA. Em algumas centenas de milissegundos, a dupla hélice do DNA se desenrola para formar um nó conhecido como bolha de transcrição, de modo que uma fita de DNA exposta pode ser copiada em uma fita de RNA complementar.
Como a RNAP realiza esse feito é em grande parte desconhecido. Um instantâneo da RNAP no ato de abrir essa bolha forneceria uma riqueza de informações, mas o processo acontece muito rápido para que a tecnologia atual capture facilmente visualizações dessas estruturas. Agora, um novo estudo em Natureza Biologia Estrutural e Molecular descreve a RNAP da E. coli no ato de abrir a bolha de transcrição.
As descobertas, capturadas em 500 milissegundos da mistura de RNAP com DNA, lançam luz sobre mecanismos fundamentais da transcrição e respondem a perguntas de longa data sobre o mecanismo de iniciação e a importância de suas várias etapas. “Esta é a primeira vez que alguém conseguiu capturar complexos de transcrição transitórios conforme eles se formam em tempo real”, diz a primeira autora Ruth Saecker, especialista em pesquisa no laboratório de Seth Darst na Rockefeller. “Entender esse processo é crucial, pois é uma importante etapa regulatória na expressão genética.”
Uma visão sem precedentes
Darst foi o primeiro a descrever a estrutura da RNAP bacteriana, e destrinchar seus pontos mais sutis continua sendo um foco importante de seu laboratório. Embora décadas de trabalho tenham estabelecido que a ligação da RNAP a uma sequência específica de DNA desencadeia uma série de etapas que abrem a bolha, como a RNAP separa os filamentos e posiciona um filamento em seu sítio ativo continua sendo um debate acalorado.
Os primeiros trabalhos no campo sugeriram que a abertura da bolha atua como uma desaceleração crítica no processo, ditando a rapidez com que a RNAP pode passar para a síntese de RNA. Resultados posteriores no campo desafiaram essa visão, e várias teorias surgiram sobre a natureza dessa etapa limitadora de taxa. “Sabíamos por outras técnicas biológicas que, quando a RNAP encontra o DNA pela primeira vez, ela produz um monte de complexos intermediários que são altamente regulados”, diz o coautor Andreas Mueller, um bolsista de pós-doutorado no laboratório. “Mas essa parte do processo pode acontecer em menos de um segundo, e não conseguimos capturar estruturas em uma escala de tempo tão curta.”
Para entender melhor esses complexos intermediários, a equipe colaborou com colegas do New York Structural Biology Center, que desenvolveram um sistema robótico baseado em jato de tinta que poderia preparar rapidamente amostras biológicas para análise de microscopia crioeletrônica. Por meio dessa parceria, a equipe capturou complexos se formando nos primeiros 100 a 500 milissegundos do RNAP encontrando o DNA, produzindo imagens de quatro complexos intermediários distintos com detalhes suficientes para permitir a análise.
Pela primeira vez, uma imagem clara das mudanças estruturais e intermediários que se formam durante os estágios iniciais da ligação da RNA polimerase ao DNA entrou em foco. “A tecnologia foi extremamente importante para este experimento”, diz Saecker. “Sem a capacidade de misturar DNA e RNAP rapidamente e capturar uma imagem deles em tempo real, esses resultados não existem.”
Colocando-se em posição
Ao examinar essas imagens, a equipe conseguiu delinear uma sequência de eventos mostrando como o RNAP interage com os filamentos de DNA conforme eles se separam, em níveis de detalhes nunca antes vistos. Conforme o DNA se desenrola, o RNAP gradualmente agarra um dos filamentos de DNA para impedir que a dupla hélice se junte novamente. Cada nova interação faz com que o RNAP mude de forma, permitindo que mais conexões proteína-DNA se formem. Isso inclui empurrar para fora uma parte de uma proteína que bloqueia a entrada do DNA no sítio ativo do RNAP. Uma bolha de transcrição estável é então formada.
A equipe propõe que a etapa limitante da taxa na transcrição pode ser o posicionamento da fita do molde de DNA dentro do sítio ativo da enzima RNAP. Esta etapa envolve superar barreiras energéticas significativas e reorganizar vários componentes. Pesquisas futuras terão como objetivo confirmar esta nova hipótese e explorar outras etapas na transcrição.
“Nós apenas olhamos para os primeiros passos neste estudo”, diz Mueller. “Em seguida, esperamos olhar para outros complexos, pontos de tempo posteriores e passos adicionais no ciclo de transcrição.”
Além de resolver teorias conflitantes sobre como as fitas de DNA são capturadas, esses resultados destacam o valor do novo método, que pode capturar eventos moleculares acontecendo em milissegundos em tempo real. Essa tecnologia permitirá muito mais estudos desse tipo, ajudando os cientistas a visualizar interações dinâmicas em sistemas biológicos.
“Se quisermos entender um dos processos mais fundamentais da vida, algo que todas as células fazem, precisamos entender como seu progresso e velocidade são regulados”, diz Darst. “Quando soubermos disso, teremos uma imagem muito mais clara de como a transcrição começa.”
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