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No centro de cada reação CRISPR, seja ocorrendo naturalmente em bactérias ou aproveitada pela tecnologia de edição de genes CRIPSR-Cas, está uma forte ligação molecular de uma proteína Cas por meio de um RNA guia para seu local de destino no DNA. É como uma amarração de esqui em nanoescala.
“Existe um equilíbrio entre amarrar de forma estável e sair na hora certa”, disse Michelle Wang, professora ilustre de ciências físicas de James Gilbert White e pesquisadora do Instituto Médico Howard Hughes na Faculdade de Artes e Ciências. “O que realmente queremos é a capacidade de modular a afinidade. Isso nos dá a possibilidade de ajustar o potencial de edição de genes.”
Uma ligação à proteína Cas não pode ser muito transitória, de acordo com Porter Hall, candidato a doutorado em biofísica no Wang Lab e principal autor da publicação. Se não conseguir ligar de forma estável a região alvo do DNA, a edição precisa do gene pode não ser eficiente, levando potencialmente a efeitos fora do alvo. “Mas se a proteína permanecer lá para sempre, então o processo de edição do gene não pode ser concluído”, disse Hall.
Examinando os mecanismos precisos de nível molecular envolvidos na ligação de Cas ao DNA, Wang e seus colegas fornecem a primeira explicação mecanicista de como uma proteína motora (RNA polimerase) remove um dCas ligado, uma versão de Cas projetada para reconhecer uma sequência de DNA sem realizar uma cortar.
Esse insight revela como ajustar a remoção de Cas, contribuindo para futuras aplicações CRISPR.
“Polarity of the CRISPR Roadblock to Transcription” publicado em 5 de dezembro em Natureza Biologia Molecular e Estrutural. Outros colaboradores são os membros do laboratório James Inman, Robert Fulbright e Tung Le, juntamente com os colaboradores Guillaume Lambert, professor assistente de física aplicada e de engenharia da Cornell Engineering, e Joshua Brewer e Seth Darst da Rockefeller University.
“Para realizar plenamente o potencial da tecnologia CRISPR, é crucial obter uma compreensão mecanística aprofundada da estabilidade de ligação do Cas”, escreveram os pesquisadores. “Este trabalho destaca a importância do R-loop na estabilidade de ligação do dCas e fornece insights mecanísticos valiosos para amplas aplicações da tecnologia CRISPR”.
O Wang Lab investiga como as proteínas motoras se movem enquanto viajam pelas cadeias de DNA, realizando processos biológicos vitais.
A proteína motora RNA polimerase exerce força sobre os “bloqueios” enquanto realiza sua função de expressão gênica, copiando o DNA para o RNA, disse Wang. Neste estudo, o obstáculo foi Cas deficiente em endonuclease (dCas).
Anteriormente, usando pinças nanofotônicas, os pesquisadores separaram mecanicamente as duas fitas de DNA para mapear onde a proteína dCas ligada está no DNA. Eles chamam isso de mapeador de descompactação de DNA.
Pesquisas anteriores estabeleceram que a remoção de dCas por uma proteína motora é possível apenas de um lado (uma polaridade). Usando o mapeador descompactado para o estudo atual, os pesquisadores de Cornell descobriram o porquê: como a RNA polimerase pode colapsar o loop formado entre o RNA guia e o DNA alvo (chamado de “R-loop”) de um dCas ligado apenas de um lado, o lado distal (ou distante) do PAM (motivo protoespaçador adjacente), uma sequência curta de DNA de 2 a 6 pares de bases de comprimento, que segue a região de DNA direcionada para clivagem.
Depois que os pesquisadores descrevem como o mecanismo funciona, eles também mostram como ajustar a estabilidade do loop dCas R, modificando o RNA guia.
“Esperamos que o conhecimento fundamental de como as proteínas Cas funcionam possa levar a uma edição de genes mais eficiente e aplicações mais amplas da tecnologia CRISPR”, disse Wang.
Fonte da história:
Materiais fornecidos por Universidade de Cornell. Original escrito por Kate Blackwood, cortesia do Cornell Chronicle. Observação: o conteúdo pode ser editado quanto ao estilo e tamanho.
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