A edição primária usa transcrição reversa guiada por CRISPR para permitir a introdução programável de qualquer substituição de base desejada ou pequena inserção ou exclusão. Um desafio para o uso de sistemas de edição de prime é o grande tamanho da proteína de edição de prime necessária 2 (PE2). Consistindo de nSpCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9 nickase) com um MMLV mutado -RT (Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) domínio fundido ao seu terminal C, PE2 é tipicamente 2.117 aminoácidos codificados por 6.351 pares de bases.
Os pesquisadores do Massachusetts General Hospital (MGH) criaram um sistema chamado Split Prime Editing (Split-PE), que separou as proteínas nSpCas9 e MMLV-RT para funcionar tão eficientemente quanto o PE2 intacto em células humanas. Esses resultados e reagentes têm implicações importantes para melhorar a edição primária e devem ajudar a acelerar a otimização e aplicação da edição primária para pesquisa e usos terapêuticos.
O artigo de pesquisa intitulado “Engineered CRISPR prime editors with compact, untethered reverse transcriptases” foi publicado em 26 de setembro de 2022, em Nature Biotechnology .
Nos sistemas de edição primária existentes, mutações são induzidas por uma proteína de edição primária e um RNA guia de edição primária (pegRNA). Este pegRNA direciona a atividade de nSpCas9 para criar um R-loop com uma fita de DNA cortada, que se liga a uma sequência de ligação ao primer (PBS) na extremidade 3′ do pegRNA. A parte da transcriptase reversa da proteína de edição primária transcreve então o modelo de transcrição reversa que é adjacente ao PBS em DNA, codificando a edição desejada de interesse. Este modelo de DNA media a introdução da edição no locus genômico por um mecanismo que ainda não está totalmente definido.
Visão geral esquemática da edição principal. a, A proteína PE2 consiste em Streptococcus pyogenes Cas9 nickase (nSpCas9 em cinza) com um domínio pentamutante MMLV-RT fundido a seu C-terminal (rosa claro). PE2 é programado para direcionar um locus genômico de interesse com um pegRNA (roxo). Um R-loop é formado após a ligação da ribonucleoproteína PE-pegRNA (RNP) ao protoespaçador na fita alvo (TS) no DNA. nSpCas9 introduz um corte (círculo vermelho com preenchimento branco) na fita não-alvo (NTS). A extensão 3′ consiste em um sítio de ligação ao primer (PBS, azul) e um modelo de transcrição reversa (RTT, rosa). b, O PBS do pegRNA hibrida-se com o NTS a montante de onde o corte foi introduzido. c, O domínio RT estende um retalho de DNA 3′ de fita simples (verde) do NTS cortado usando o RTT, que codifica a edição desejada. Para a estratégia PE3, um segundo gRNA (ngRNA) corta o TS (oposto à aba 3′) a montante ou a jusante do sítio alvo de edição principal.
Otimizando a edição principal
Os primeiros autores Julian Grünewald, Bret R. Miller e Regan N. Szalay do MGH descobriram que as transcriptases reversas e os componentes nCas9 das proteínas de edição primária funcionam eficientemente mesmo quando separadas. Os pesquisadores do MGH usam este sistema Split-PE (edição principal) para identificar e projetar rapidamente arquiteturas de editor principal mais compactas que também ampliam os tipos de transcriptases reversas usadas para edição principal.
Os resultados sugerem fortemente que, com proteínas de edição primária intactas existentes, a atividade da transcriptase reversa é provavelmente fornecida por uma segunda molécula de edição primária presumivelmente não ligada ao sítio de DNA alvo, possivelmente a partir da solução. Isso, por sua vez, implica que a eficiência da edição primária pode ser aumentada ainda mais pela criação de diferentes fusões de próxima geração nas quais as transcriptases reversas realmente devem funcionar em cis para o nCas9 (ou seja, uma configuração na qual a atividade da transcriptase reversa é dependente de sendo vinculado ao site de destino).
Entrega de edição principal aprimorada
Os Split-PEs e as transcriptases reversas de tamanho reduzido descritos fornecem reagentes e arquiteturas que deve aprimorar e permitir melhor a entrega de componentes de edição principais e acelerar outras melhorias na plataforma. Split-PEs abordam uma limitação imposta por vetores AAV de tamanho restrito – que a proteína PE2 de comprimento total é muito grande para caber em um único vetor AAV. Ao alavancar a arquitetura Split-PE, pode-se codificar a proteína nSpCas9 em um AAV e o pegRNA/gRNA e a transcriptase reversa em outro. Isso cria uma configuração na qual apenas as células transduzidas por ambos os vetores serão editadas sem a necessidade de componentes adicionais.
Os autores também observam que nosso Espera-se que o sistema Split-PE melhore e simplifique os métodos de entrega de RNA e ribonucleoproteína devido à expressão mais eficiente de nCas9 de comprimento mais curto e componentes de transcriptase reversa em vez de uma fusão de comprimento total desses dois componentes. Essa modularidade também deve permitir a triagem rápida de cortes alternativos Cas9 ou outros nickases para edição principal.
Expandindo o Prime Editing Toolkit
Esses estudos demonstram que a divisão A arquitetura pode facilitar a triagem mais rápida de novas variantes do editor principal com propriedades aprimoradas. Em vez de clonar e sequenciar uma nova fusão longa para cada variante da transcriptase reversa e determinar onde e como fundir cada uma delas a um Cas9 de corte, os pesquisadores do MGH foram capazes de construir rapidamente e, em seguida, rastrear uma extensa série de diferentes vírus, não-virais. , e transcriptases reversas projetadas para identificar aqueles com atividades desejadas.
Esta descoberta abre a possibilidade de mineração do grande número de não- transcriptases reversas de íntrons do grupo II bacterianas virais (G2I-RTs) que existem em diversas bactérias e archaea como pontos de partida para a engenharia de editores principais que não são apenas menores, mas que também podem fornecer funções aprimoradas, como maior fidelidade ou maior processabilidade. O enorme tamanho desse tesouro de transcriptases reversas que podem ser usadas para edição primária é evidente a partir de uma pesquisa computacional recente que rendeu mais de 4.000 G2I-RTs.
