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A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é um distúrbio de degeneração muscular causado por mutações que afetam o gene da distrofina. Em 24 de agostoº no diário Relatórios de células-tronco, os pesquisadores mostram como um método duplo de RNA CRISPR restaurou a função da proteína distrofina em células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de pacientes com DMD. A abordagem funcionou removendo grandes secções do gene da distrofina, permitindo que as células saltassem secções defeituosas ou desalinhadas do código genético. Isto produz proteínas truncadas, mas ainda funcionais, para uma ampla variedade de padrões de mutação associados à DMD.
“Dual CRISPR-Cas3 é uma ferramenta promissora para induzir uma deleção genômica gigantesca e restaurar a proteína distrofina por meio da indução de salto de múltiplos éxons”, disse o autor sênior Akitsu Hotta, da Universidade de Kyoto. “Esperamos que este estudo esclareça novas formas de tratar pacientes com DMD e outras doenças genéticas que requerem deleções extensas”.
Devido a variações significativas nos padrões de mutação que afectam o gene da distrofina, a eliminação de uma pequena secção do gene só pode ser utilizada para um número limitado de pacientes com DMD. Por exemplo, o salto mono-éxon mais comum dos éxons 51, 53 e 45 pode ser aplicado a 13%, 8% e 8% dos pacientes com DMD, respectivamente.
O salto multi-éxon (MES) tem ampla aplicabilidade a vários padrões de mutação DMD. Ao atingir os pontos críticos de mutação no gene da distrofina, estimou-se que o MES do éxon 45 ao 55 beneficiou mais de 60% dos pacientes com DMD. Infelizmente, poucas técnicas estão disponíveis para induzir uma grande deleção para cobrir os éxons alvo espalhados por várias centenas de quilobases.
Para superar esse obstáculo, Hotta e sua equipe usaram CRISPR-Cas3 para induzir uma deleção de até 340 quilobases na região do éxon 45-55 da distrofina em vários padrões de mutação DMD. Como era raro observar uma eliminação de mais de cem quilobases usando um único RNA CRISPR – o que ajuda a localizar o segmento correto de DNA – os pesquisadores usaram um par de RNAs CRISPR intercalando a região genômica alvo.
Os autores observam limitações potenciais do sistema duplo de RNA CRISPR. Primeiro, há variação no padrão de exclusão e os pontos iniciais e finais precisos da exclusão não podem ser totalmente controlados. Isso pode ser uma desvantagem quando é necessária uma exclusão grande, mas precisa. Em segundo lugar, o estudo não demonstrou a funcionalidade da proteína distrofina recuperada. Terceiro, outros métodos devem ser desenvolvidos para melhorar a eficiência geral da edição do genoma do sistema Cas3.
“Nosso sistema dual-Cas3 pode ser aplicado a futuras terapias genéticas, uma vez que formos capazes de entregar os componentes dual-Cas3 na Vivo aos tecidos musculares esqueléticos com segurança e eficiência”, diz Hotta. “A capacidade de induzir várias centenas de quilobases de deleção de DNA também tem ampla aplicabilidade para pesquisa básica quando uma grande deleção é necessária.”
Este estudo foi parcialmente apoiado pela Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência, pelo Fundo de Pesquisa Celular iPS e pelo Centro Nacional de Neurologia e Psiquiatria. Akitsu Hotta é consultor científico do C4U e vários coautores submeteram uma patente relativa a este estudo.
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