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Visualizações sem precedentes do interior das células e outras estruturas em nanoescala agora são possíveis graças às inovações na microscopia de expansão. Os avanços podem ajudar a fornecer informações futuras sobre neurociência, patologia e muitos outros campos biológicos e médicos.
No artigo “Magnify é uma estratégia de ancoragem molecular universal para microscopia de expansão”, publicado em 2 de janeiro na revista Natureza Biotecnologiacolaboradores da Carnegie Mellon University, da University of Pittsburgh e da Brown University descrevem novos protocolos para o chamado Magnify.
“O Magnify pode ser uma ferramenta poderosa e acessível para a comunidade de biotecnologia”, disse Yongxin (Leon) Zhao, professor associado de Ciências Biológicas de Desenvolvimento de Carreira da Família Eberly.
O Laboratório de Biofotônica de Zhao é líder no campo de habilitação de imagens de super-resolução de amostras biológicas por meio de amostras fisicamente expandidas em um processo conhecido como microscopia de expansão. Através do processo, as amostras são incorporadas em um hidrogel expansível que se expande de forma homogênea para aumentar a distância entre as moléculas, permitindo que sejam observadas em maior resolução. Isso permite que estruturas biológicas em nanoescala que anteriormente só podiam ser visualizadas usando técnicas caras de imagem de alta resolução sejam vistas com ferramentas de microscopia padrão.
Magnify é uma variante da microscopia de expansão que permite aos pesquisadores usar uma nova fórmula de hidrogel, inventada pela equipe de Zhao, que retém um espectro de biomoléculas, oferece uma aplicação mais ampla a uma variedade de tecidos e aumenta a taxa de expansão em até 11 vezes linearmente ou ~1.300 dobras do volume original.
“Superamos alguns dos desafios de longa data da microscopia de expansão”, disse Zhao. “Um dos principais pontos de venda do Magnify é a estratégia universal de manter as biomoléculas do tecido, incluindo proteínas, fragmentos de núcleo e carboidratos, dentro da amostra expandida”.
Zhao disse que manter intactos os diferentes componentes biológicos é importante porque os protocolos anteriores exigiam a eliminação de várias biomoléculas que mantinham os tecidos unidos. Mas essas moléculas podem conter informações valiosas para os pesquisadores.
“No passado, para tornar as células realmente expansíveis, era preciso usar enzimas para digerir proteínas, então, no final, você tinha um gel vazio com rótulos que indicavam a localização da proteína de interesse”, disse ele. Com o novo método, as moléculas são mantidas intactas e vários tipos de biomoléculas podem ser marcados em uma única amostra.
“Antes, era como ter perguntas de escolha única. Se você quiser rotular proteínas, essa seria a versão um do protocolo. Se você quiser rotular núcleos, seria uma versão diferente”, disse Zhao. “Se você quisesse fazer imagens simultâneas, era difícil. Agora, com o Magnify, você pode escolher vários itens para rotular, como proteínas, lipídios e carboidratos, e imaginá-los juntos.”
Os pesquisadores de laboratório Aleksandra Klimas, uma pesquisadora de pós-doutorado e Brendan Gallagher, um estudante de doutorado, foram os primeiros coautores do artigo.
“Esta é uma maneira acessível de obter imagens de espécimes em alta resolução”, disse Klimas. “Tradicionalmente, você precisa de equipamentos caros, reagentes e treinamento específicos. No entanto, esse método é amplamente aplicável a muitos tipos de preparações de amostras e pode ser visualizado com microscópios padrão que você usaria em um laboratório de biologia.”
Gallagher, que tem formação em neurociência, disse que seu objetivo era tornar os protocolos o mais compatíveis possível para os pesquisadores que poderiam se beneficiar da adoção do Magnify como parte de seus kits de ferramentas.
“Um dos conceitos-chave que tentamos manter em mente foi encontrar os pesquisadores onde eles estão e fazer com que mudassem o mínimo possível de coisas em seus protocolos”, disse Gallagher. “Ele funciona com diferentes tipos de tecidos, métodos de fixação e até tecidos que foram preservados e armazenados. É muito flexível, pois você não precisa necessariamente redesenhar completamente os experimentos com o Magnify em mente; ele funcionará com o que você já tem .”
Para pesquisadores como Simon Watkins, fundador e diretor do Center for Biologic Imaging da Universidade de Pittsburgh e do Pittsburgh Cancer Institute, o fato de o novo protocolo ser compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos – incluindo seções de tecidos preservados – – é importante. Por exemplo, a maioria dos métodos de microscopia de expansão é otimizada para tecido cerebral. Em contraste, o Magnify foi testado em amostras de vários órgãos humanos e tumores correspondentes, incluindo mama, cérebro e cólon.
“Digamos que você tenha um tecido com componentes densos e não densos, isso envolve tecidos que anteriormente não se expandiam isometricamente”, disse Watkins. “Leon tem trabalhado duro nisso para fazer este protocolo funcionar com tecidos que foram arquivados.”
Xi (Charlie) Ren, professor assistente de engenharia biomédica na Carnegie Mellon, estuda o tecido pulmonar e como modelar sua morfogênese e patogênese. Parte de sua pesquisa envolve a pesquisa dos cílios móveis que funcionam para limpar o muco nas vias aéreas humanas. Com 200 nanômetros de diâmetro e apenas alguns micrômetros de comprimento, as estruturas são muito pequenas para serem vistas sem tecnologia demorada, como a microscopia eletrônica. Trabalhando em colaboração com o laboratório de Zhao, a equipe de Ren desenvolveu e entregou modelos de organoides pulmonares com defeitos específicos na ultraestrutura e função dos cílios para validar a capacidade do Magnify de visualizar patologia ciliar clinicamente relevante.
“Com as mais recentes técnicas do Magnify, podemos expandir esses tecidos pulmonares e começar a ver alguma ultraestrutura dos cílios móveis, mesmo com um microscópio comum, e isso agilizará as investigações básicas e clínicas”, disse ele.
Os pesquisadores também foram capazes de visualizar defeitos nos cílios em células pulmonares específicas do paciente conhecidas por terem mutações genéticas.
“A comunidade de engenharia de tecido pulmonar sempre precisa de uma maneira melhor de caracterizar o sistema de tecido com o qual trabalhamos”, disse Ren. Ele acrescentou que este trabalho é um primeiro passo importante e espera que o trabalho colaborativo com o laboratório de Zhao seja ainda mais refinado e aplicado a amostras de patologia encontradas em bancos de tecidos.
Por fim, o hidrogel usado no Magnify e desenvolvido no laboratório de Zhao é mais robusto que seu antecessor, que era muito frágil, causando quebras durante o processo.
“Esperamos desenvolver esta tecnologia para torná-la mais acessível à comunidade”, disse ele. “Há diferentes direções que isso pode tomar. Há muito interesse em usar esse tipo de tecnologia de expansão de tecido para ciência básica.”
Alison Barth, professora de Maxwell H. e Gloria C. Connan em Ciências da Vida na Carnegie Mellon, estuda a conectividade sináptica durante o aprendizado. Ela disse que as amplas aplicações fornecidas pelos novos métodos serão uma benção para os pesquisadores.
“O cérebro é um ótimo lugar para tirar proveito dessas técnicas de super-resolução”, disse Barth, que colabora com o Zhao Lab em vários estudos. “Os métodos de microscopia serão benéficos para fenotipagem sináptica e análise em diferentes condições cerebrais.
“Um dos principais avanços neste papel é a capacidade do método para trabalhar em muitos tipos diferentes de espécimes de tecido.”
Autores de estudos adicionais incluem Piyumi Wijesekara, Emma F. DiBernardo, Zhangyu Cheng da Carnegie Mellon; Sinda Fekir e Christopher I. Moore, da Brown University; Donna B. Stolz de Pitt; Franca Cambi da Pitt and Veterans Administration; e Steven L Brody e Amjad Horani da Universidade de Washington.
Este trabalho foi apoiado por Carnegie Mellon, Kaufman Foundation e DSF Charitable Foundation, Departamento de Defesa dos EUA (VR190139), National Institutes of Health (DP2 OD025926-01 e NIH RF1 MH114103), Air Force Office of Scientific Research (FA9550 -19-1-13022629), NeuroNex (GR5260228.1001) e Brown University.
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