.
Quando as bactérias são atacadas por um vírus, elas podem se defender com um mecanismo que afasta o material genético introduzido pelo intruso. A chave são os complexos de proteínas CRISPR-Cas. Foi somente na última década que sua função de imunidade adaptativa em microrganismos foi descoberta e elucidada. Com a ajuda de um RNA embutido, os complexos CRISPR reconhecem uma pequena sequência no DNA do atacante. Desde então, o mecanismo de reconhecimento de sequência pelo RNA tem sido usado para desativar e modificar seletivamente os genes em qualquer organismo. Essa descoberta revolucionou a engenharia genética e já foi homenageada em 2020 com o Prêmio Nobel de Química concedido a Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna.
Ocasionalmente, no entanto, os complexos CRISPR também reagem a segmentos gênicos que diferem ligeiramente da sequência especificada pelo RNA. Isso leva a efeitos colaterais indesejáveis em aplicações médicas. “As causas disso ainda não são bem compreendidas, pois o processo não pôde ser observado diretamente até agora”, diz Dominik Kauert, que trabalhou no projeto como aluno de doutorado.
Processos em nanoescala rastreados em detalhes
Para entender melhor o processo de reconhecimento, a equipe liderada pelos professores Ralf Seidel e Dominik Kauert aproveitou o fato de que a dupla hélice de DNA da sequência-alvo é desenrolada durante o reconhecimento para permitir o pareamento de bases com o RNA. “A questão central do projeto era, portanto, se o desenrolamento de um pedaço de DNA com apenas 10 nanômetros (nm) de comprimento poderia ser rastreado em tempo real”, diz Kauert.
Para observar o processo de desenrolamento em detalhes, os cientistas tiveram que torná-lo visível ao microscópio. Para atingir esse objetivo, a equipe se baseou nas conquistas da nanotecnologia de DNA, que pode ser usada para criar qualquer nanoestrutura de DNA tridimensional. Usando a chamada técnica de origami de DNA, os pesquisadores construíram um braço de rotor de DNA de 75 nm de comprimento com uma nanopartícula de ouro presa à sua extremidade. No experimento, o desenrolamento da sequência de DNA de 2 nm de espessura e 10 nm de comprimento foi transferido para a rotação da nanopartícula de ouro ao longo de um círculo com diâmetro de 160 nm – esse movimento pode ser ampliado e rastreado usando uma configuração especial de microscópio.
Com esse novo método, os pesquisadores puderam observar o reconhecimento da sequência pelo complexo CRISPR Cascade quase par de bases por par de bases. Surpreendentemente, o emparelhamento de bases com o RNA não é energeticamente vantajoso, o que significa que o complexo é ligado apenas de forma instável durante o reconhecimento da sequência. Somente quando toda a sequência é reconhecida ocorre a ligação estável e o DNA é subsequentemente destruído. Se for a sequência de destino “errada”, o processo é abortado.
As descobertas ajudarão na seleção de sequências de RNA adequadas
O facto de o processo de reconhecimento por vezes produzir resultados incorretos deve-se à sua natureza estocástica, ou seja, a movimentos moleculares aleatórios, como os investigadores puderam agora demonstrar. “O reconhecimento de sequência é impulsionado por flutuações térmicas no emparelhamento de bases”, diz Kauert. Com os dados obtidos, foi possível criar um modelo termodinâmico de reconhecimento de sequência que descreve o reconhecimento de segmentos desviantes de sequência. No futuro, isso deve permitir uma melhor seleção de sequências de RNA que reconheçam apenas a sequência alvo desejada, otimizando assim a precisão da manipulação genética.
Como os nanorotores projetados são universais em sua adequação para medir torções e torques em moléculas individuais, eles também podem ser usados para outros complexos ou biomoléculas CRISPR-Cas.
O trabalho foi financiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa e pela Fundação Alemã de Pesquisa e realizado em colaboração com o grupo de pesquisa do professor Virginijus Siksnys da Universidade de Vilnius, na Lituânia, que isolou e forneceu os complexos CRISPR usados.
.
