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Uma fita de dupla hélice de DNA pode se estender por quase dois metros, mas é tão firmemente enrolada que empacota uma sequência inteira de nucleotídeos no minúsculo núcleo de uma célula. Se esse mesmo ADN fosse dividido em duas cadeias e dividido em muitos, muitos pedaços curtos, tornar-se-ia triliões de estruturas moleculares 3D dobradas de forma única, capazes de se ligarem e possivelmente manipularem moléculas com formas específicas – se elas se encaixassem perfeitamente.
Esses segmentos curtos e de fita simples de DNA ou RNA são chamados de aptâmeros, também conhecidos como “anticorpos químicos”. Segundo pesquisadores da Penn State, eles estão surgindo na biomedicina como agentes terapêuticos ou de diagnóstico benéficos, especialmente na substituição de anticorpos biológicos. No entanto, encontrar o aptâmero perfeito para uma molécula alvo – a proteína p53 que suprime tumores cancerígenos, por exemplo – requer a análise de um conjunto de potenciais candidatos a aptâmeros que excede o número de estrelas na Via Láctea. O processo pode levar meses e muitas vezes resulta em nenhuma correspondência.
Um novo método desenvolvido por pesquisadores da Penn State usa um hidrogel – uma rede de polímero que mantém sua forma e pode se expandir quando absorve uma grande quantidade de água – para reter aptâmeros de “alta afinidade”, ou bem ajustados, enquanto o o resto dos candidatos a aptâmeros deixam o gel em 60 horas. A equipe relatou seu método e descobertas de “hidrogel para seleção de aptâmeros” (HAS) ontem (5 de outubro) em Biotecnologia da Natureza.
O método HAS pode reduzir a barreira para os investigadores que procuram explorar o potencial dos aptâmeros – que são mais fáceis de modificar, têm uma vida útil mais longa e permitem um acesso mais fácil aos tecidos do que os anticorpos – numa série de aplicações biomédicas, como a medicina regenerativa. , entrega de medicamentos, engenharia celular, bioimagem e muito mais, de acordo com o autor correspondente Yong Wang, professor de engenharia biomédica na Penn State.
“O procedimento de encontrar aptâmeros é frustrante não apenas para iniciantes, mas também para pesquisadores experientes – como encontrar uma agulha em um palheiro”, disse Wang. “Muitos pesquisadores estão interessados em usar aptâmeros para seus projetos, mas como é muito difícil obtê-los, eles não podem testar suas ideias ou explorar novas aplicações. Os aptâmeros podem ser usados como terapêuticos por si só, eles podem ser conjugados com drogas ou nanopartículas para orientar a entrega e melhorar a eficácia, eles podem ser aplicados para funcionalizar um kit de detecção para examinar se uma amostra de sangue contém vírus ou biomarcadores de câncer. Basicamente, os aptâmeros podem ser aplicados em qualquer lugar em que os anticorpos sejam projetados. “
O hidrogel da equipe – feito de polietilenoglicol (PEG) – incluía moléculas-alvo imobilizadas da proteína trombina, que ajuda a facilitar a coagulação na corrente sanguínea. Depois que uma biblioteca de aptâmeros foi injetada no hidrogel, os candidatos de alta afinidade ligaram-se aos alvos imóveis, enquanto os aptâmeros menos bem ajustados se difundiram livremente através de seus poros, da mesma forma que enfeites sem ganchos cairiam através de uma árvore de Natal sem nada para pegar. para os galhos.
Esta abordagem de difusão difere dos métodos tradicionais, onde as moléculas alvo e a biblioteca de aptâmeros são misturadas numa solução e depois filtradas através de uma membrana fina. A etapa de filtração é repetida muitas vezes e onde bons candidatos a aptâmeros são frequentemente perdidos, de acordo com Wang.
“Infelizmente, a ligação molecular é uma interação física e, durante a etapa de filtração, candidatos específicos podem se separar das moléculas-alvo, atravessar a membrana e se perder”, disse Wang. “Em nosso método, um candidato a aptâmero desejado se ligará novamente a uma molécula imobilizada se ela se separar de uma molécula alvo anteriormente ligada. Portanto, o candidato não será facilmente perdido durante o procedimento de difusão.”
Os pesquisadores criaram o hidrogel poroso congelando uma solução de pré-gelificação misturada com ácido acrílico, que posteriormente reagiria quimicamente aos grupos carboxila do polímero para formar as proteínas trombina incorporadas, imobilizadas para não sair do hidrogel. Cristais de gelo também apareceram durante esse processo de “criogelação”, espalhados por toda a rede do polímero PEG, eventualmente derretendo e criando os poros do hidrogel quando ele foi levado à temperatura ambiente. O PEG é “não incrustante”, disse Wang, o que significa que o material limita a ligação indesejada dos aptâmeros ao hidrogel, ao contrário das interações dos aptâmeros com as membranas.
O método HAS também elimina a necessidade de amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), uma etapa nos métodos tradicionais onde uma nova biblioteca de aptâmeros é gerada sinteticamente a cada rodada com base nos aptâmeros restantes na membrana anterior.
“A amplificação é baseada em PCR que tende a amplificar alguns candidatos em vez de tratar todos os candidatos igualmente”, disse Wang. “Os pesquisadores descobriram que esse preconceito pode se tornar cada vez mais grave cada vez que se repete, e eles podem não encontrar o que desejam depois de investir muito tempo, trabalho e dinheiro”.
Como teste de linha de base, os pesquisadores desenvolveram um hidrogel de PEG sem a trombina incorporada e introduziram a biblioteca de aptâmeros, descobrindo que quase não havia aptâmeros restantes no gel após 60 horas. Isso indicou que o “ruído de fundo” da ligação não específica – aptâmero ao hidrogel – havia se dissipado e se tornou o limite de tempo que os pesquisadores usaram em seu processo de teste.
Os candidatos a aptâmeros no hidrogel imobilizado com trombina foram coletados e analisados com tecnologia de sequenciamento de última geração. Os pesquisadores priorizaram 50 candidatos a aptâmeros, categorizando-os ainda mais e testando a eficiência de ligação. Verificou-se que o “aptâmero antitrombina” identificado no conjunto tinha uma afinidade de ligação comparável àquelas identificadas ao longo de 10 ciclos de seleção de aptâmeros utilizando métodos tradicionais.
“A seleção de aptâmeros pode ser alcançada em uma única etapa, sem a necessidade de um processo reiterativo, e todas as preocupações com operações reiterativas são evitadas”, disse Wang, acrescentando que trabalhos futuros no método HAS irão ajustar esta abordagem, incluindo a seleção de aptâmeros para moléculas alvo não proteicas ou mesmo células vivas se puderem ser mantidas no hidrogel em condições ambientais. “Esperamos que o HAS ajude os pesquisadores a explorar vários campos que requerem ligação ou reconhecimento molecular.”
Os colaboradores deste estudo também incluíram o coautor Naveen Singh, ex-pesquisador de pós-doutorado no Departamento de Engenharia Biomédica da Penn State, agora no Instituto Indiano de Tecnologia de Delhi; bem como o coautor Yixun Wang, Connie Wen, Brandon Davis, Xuelin Wang e Kyungsene Lee, todos estudantes de doutorado em engenharia biomédica da Penn State.
Os Institutos Nacionais de Saúde financiaram este trabalho.
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