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As bactérias usam um arsenal de armas para combater as drogas destinadas a matá-las. Entre as mais prevalentes dessas armas estão as enzimas modificadoras de ribossomos. Essas enzimas estão se tornando cada vez mais comuns, aparecendo em todo o mundo em amostras clínicas de uma variedade de bactérias resistentes a medicamentos.
Agora os cientistas capturaram as primeiras imagens de uma classe importante dessas enzimas em ação. As imagens mostram como as enzimas se prendem a um local específico no ribossomo bacteriano e o espremem como uma pinça para extrair um nucleotídeo de RNA e alterá-lo. O Anais da Academia Nacional de Ciências (PNAS) publicou as descobertas, lideradas por cientistas da Emory University.
A técnica avançada de microscopia crioeletrônica possibilitou instantâneos tridimensionais de resolução ultra-alta.
“Ver é acreditar”, diz Christine Dunham, professora de química da Emory e co-autora correspondente do artigo. “No minuto em que você vê estruturas biológicas interagindo na vida real no nível atômico, é como resolver um quebra-cabeça. Você vê como tudo se encaixa e tem uma ideia mais clara de como as coisas funcionam.”
Os insights podem levar ao design de novas terapias antibióticas para inibir as atividades de resistência a drogas das enzimas RNA metiltransferase. Essas enzimas transferem um pequeno hidrocarboneto conhecido como grupo metil de uma molécula para outra, um processo conhecido como metilação.
“A metilação é uma das menores modificações químicas na biologia”, diz Graeme Conn, professor de bioquímica na Escola de Medicina de Emory e co-autor correspondente do artigo. “Mas esta pequena modificação pode mudar fundamentalmente a biologia. Neste caso, confere resistência que permite que as bactérias escapem de toda uma classe de antibióticos.”
Ambos Conn e Dunham também são membros do Emory Antibiotic Resistance Center.
O primeiro autor do artigo é Pooja Srinivas, que fez o trabalho como candidato a doutorado no programa de pós-graduação da Emory em farmacologia molecular e de sistemas. Desde então, ela se formou e agora é pós-doutoranda na Universidade de Washington.
Dunham é um dos principais especialistas em ribossomos – uma estrutura elaborada que funciona como uma fábrica dentro de uma célula para fabricar proteínas. As proteínas são as máquinas que fazem as células funcionarem enquanto os ácidos nucléicos, como DNA e RNA, armazenam os projetos para a vida. O ribossomo é feito principalmente de RNA, que não apenas armazena informações, mas também pode atuar como uma enzima, catalisando reações químicas.
Um dos objetivos do laboratório de Dunham é encontrar maneiras de manipular os ribossomos bacterianos para torná-los mais suscetíveis aos antimicrobianos. Se um antimicrobiano inativa com sucesso os ribossomos bacterianos, isso interrompe a fabricação de proteínas essenciais para o crescimento e sobrevivência bacteriana.
A ideia é explorar as diferenças nos ribossomos celulares humanos e nos ribossomos bacterianos, de modo que apenas a bactéria seja alvo de uma droga antimicrobiana.
Os antimicrobianos, no entanto, precisam superar as defesas bacterianas.
“É como uma corrida armamentista molecular”, explica Dunham. As bactérias continuam desenvolvendo novas armas como defesa contra drogas, enquanto os cientistas desenvolvem novas estratégias para desarmar as bactérias.
Conn é um dos principais especialistas nas armas de defesa bacteriana conhecidas como enzimas ribossômicas de RNA metiltransferase. Esta família de enzimas foi originalmente descoberta em bactérias do solo. Eles agora são cada vez mais encontrados em infecções bacterianas em pessoas e animais, tornando essas infecções mais difíceis de tratar.
“Eles continuam aparecendo cada vez mais em amostras clínicas de alguns patógenos bacterianos desagradáveis em diferentes partes do mundo”, diz Conn.
As enzimas podem levar à resistência mortal a drogas em patógenos como E. coli, salmonela, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacteriaceae. As enzimas adicionam um grupo metil em um local específico no ribossomo bacteriano. Essa adição bloqueia a capacidade de uma classe de antibióticos conhecida como aminoglicosídeos de se ligar e causar sua ação antibacteriana.
Para o papel PNAS, os pesquisadores se concentraram em um culpado dentro desta família de enzimas conhecido como ribossomal RNA metiltransferase C, ou RmtC.
Durante décadas, os pesquisadores confiaram em uma técnica conhecida como cristalografia de raios-X para revelar os detalhes atômicos de como as máquinas moleculares funcionam quando as moléculas estão dispostas em um cristal.
Em 2015, por exemplo, o laboratório de Dunham obteve imagens precisas por meio de cristalografia de raios X de como uma enzima conhecida como HigB rasga o RNA para inibir o crescimento da bactéria. Ao restringir o crescimento das bactérias que o produzem, o HigB estabelece um estado de “célula persistente” dormente que torna as bactérias tolerantes aos antibióticos.
Os segredos de como a enzima RmtC interage com o ribossomo, no entanto, iludiram a cristalografia de raios-X.
“RmtC é muito mais complicado”, explica Dunham. “É uma enzima interessante do ponto de vista da ciência básica porque parece muito diferente das outras”.
Avanços recentes em microscopia crioeletrônica abriram as portas para ampliar os mecanismos complexos de RmtC.
A microscopia crioeletrônica não requer cristalização para revelar as estruturas das moléculas e como elas interagem. Em vez disso, as amostras líquidas são congeladas rapidamente para formar uma matriz vítrea. A matriz vítrea retém a estrutura tridimensional das moléculas e as protege da deterioração pelo intenso feixe de elétrons.
Meisam Nosrati, ex-colega de pós-doutorado no laboratório de Conn e co-autor do artigo PNAS, preparou amostras de RmtC interagindo com parte de um E. coli ribossomo. Ele aproveitou a experiência do co-autor Lindsay Comstock, um químico da Wake Forest University que desenvolveu uma técnica para prender e estabilizar a enzima na posição necessária.
Nosrati então congelou as amostras em uma pequena grade e as enviou para o Pacific Northwest Center for Cryo-EM para geração de imagens.
Como estudante de pós-graduação no laboratório de Dunham, Pooja Srinivas analisou e interpretou o conjunto de dados de microscopia. Ela usou algoritmos de computador para unir milhares de imagens individuais. O resultado transformou as imagens em um flipbook que revelou a complicada estrutura do RmtC em ação.
“A enzima se prende ao ribossomo como uma pinça”, explica Dunham. “Ele aperta seu aperto até espremer um nucleotídeo do interior de uma hélice de RNA. Em seguida, modifica quimicamente esse nucleotídeo.”
A enzima é extremamente específica sobre onde ela se liga ao ribossomo, uma enorme macromolécula composta de 50 proteínas diferentes e 6.000 nucleotídeos de RNA diferentes.
Os pesquisadores usaram técnicas de bioquímica para validar que o que observaram correspondia a descobertas anteriores sobre como o RmtC torna as bactérias resistentes aos antimicrobianos aminoglicosídeos que têm como alvo o ribossomo.
Os pesquisadores agora estão tentando desenvolver novas maneiras de combater os efeitos do RmtC e enzimas relacionadas com base nas novas informações.
“O conhecimento da forma da enzima enquanto realiza sua reação química nos dá novos alvos para inibir seus efeitos”, diz Conn. “Por exemplo, poderíamos direcionar a ação de pinça da enzima para tentar impedir que ela se comprima e se ligue ao ribossomo. Agora sabemos que a enzima forma uma bolsa em sua superfície onde uma pequena molécula pode se sentar para bloquear essa ação.”
Co-autores adicionais do papel PNAS são Natalia Zelinskaya e Debayan Dey, cientistas de pesquisa no laboratório Conn.
O financiamento para o trabalho foi fornecido pelo National Institutes of Health e pelo Burroughs Wellcome Fund Investigator no Pathogenesis of Infectious Disease Award.
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