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Chame isso de um enigma CRISPR.
As bactérias usam sistemas CRISPR-Cas como sistemas imunológicos adaptativos para resistir a ataques de inimigos como vírus. Esses sistemas foram adaptados por cientistas para remover ou cortar e substituir sequências específicas de código genético em uma variedade de organismos.
Mas em um novo estudo, pesquisadores da Universidade Estadual da Carolina do Norte mostram que vírus projetados com um sistema CRISPR-Cas podem frustrar as defesas bacterianas e fazer alterações seletivas em uma bactéria alvo – mesmo quando outras bactérias estão próximas.
“Os vírus são muito bons em entregar cargas úteis. Aqui, usamos um vírus bacteriano, um bacteriófago, para entregar o CRISPR às bactérias, o que é irônico porque as bactérias normalmente usam o CRISPR para matar vírus”, disse Rodolphe Barrangou, Todd R. Klaenhammer Distinguished Professor de Ciências de Alimentos, Bioprocessamento e Nutrição da NC State e autor correspondente de um artigo que descreve a pesquisa publicada hoje em Anais da Academia Nacional de Ciências. “O vírus neste caso tem como alvo E. coli entregando DNA a ele. É como usar um vírus como seringa.”
Os pesquisadores da NC State implantaram dois bacteriófagos projetados diferentes para fornecer cargas úteis CRISPR-Cas para edição direcionada de E. coliprimeiro em um tubo de ensaio e depois em um ambiente de solo sintético criado para imitar o solo – um ambiente complexo que pode abrigar muitos tipos de bactérias.
Ambos os bacteriófagos projetados, chamados T7 e lambda, encontraram com sucesso e entregaram cargas úteis ao E. coli anfitrião na bancada do laboratório. Essas cargas expressavam genes fluorescentes bacterianos e manipulavam a resistência da bactéria a um antibiótico.
Os pesquisadores então usaram lambda para entregar o chamado editor de base de citosina ao E. coli hospedeiro. Em vez da clivagem às vezes dura de sequências de DNA do CRISPR, este editor de base mudou apenas uma letra de E. coli‘s DNA, mostrando a sensibilidade e precisão do sistema. Essas alterações inativaram certos genes bacterianos sem fazer outras alterações E. coli.
“Usamos um editor básico aqui como uma espécie de interruptor programável liga-desliga para genes em E. coli. Usando um sistema como esse, podemos fazer alterações altamente precisas de uma única letra no genoma sem a quebra de DNA de fita dupla comumente associada ao direcionamento de CRISPR-Cas”, disse Matthew Nethery, ex-aluno de doutorado da NC State e principal autor. do estudo.
Finalmente, os pesquisadores demonstraram a edição no local através do uso de um ecossistema fabricado (EcoFAB) carregado com um solo sintético de areia e quartzo, juntamente com líquido, para imitar um ambiente de solo. Os pesquisadores também incluíram três tipos diferentes de bactérias para testar se o fago poderia localizar especificamente E. coli dentro do sistema.
“Em um laboratório, os cientistas podem simplificar demais as coisas”, disse Barrangou. “É preferível modelar ambientes, então, em vez de sopa em um tubo de ensaio, queríamos examinar ambientes da vida real.”
Os pesquisadores inseriram lambda no ecossistema fabricado. Mostrou boa eficiência em encontrar E. coli e fazer as alterações genéticas direcionadas.
“Esta tecnologia permitirá que nossa equipe e outros descubram a base genética das principais interações bacterianas com plantas e outros micróbios em ambientes de laboratório altamente controlados, como EcoFABs”, disse Trent Northen, cientista do Laboratório Nacional Lawrence Berkeley do Departamento de Energia. (Berkeley Lab) que colabora com Barrangou.
“Nós vemos isso como um mecanismo para ajudar o microbioma. Podemos fazer uma mudança em uma bactéria em particular e o resto do microbioma permanece ileso”, disse Barrangou. “Esta é uma prova de conceito que pode ser empregada em qualquer comunidade microbiana complexa, o que pode se traduzir em melhor saúde das plantas e melhor saúde do trato gastrointestinal – ambientes importantes para a alimentação e a saúde.
“Em última análise, este estudo representa o próximo capítulo da entrega de CRISPR – usando vírus para entregar máquinas CRISPR em um ambiente complexo”.
Os pesquisadores planejam continuar este trabalho testando a técnica de fago CRISPR com outras bactérias associadas ao solo. É importante ressaltar que isso ilustra como as comunidades microbianas do solo podem ser manipuladas para controlar a composição e a função de bactérias associadas a plantas em ecossistemas fabricados para entender como melhorar o crescimento das plantas e promover a saúde das plantas, o que é de amplo interesse para a agricultura sustentável.
O financiamento foi fornecido por m-CAFEs Microbial Community Analysis & Functional Evaluation in Soils, uma área de foco científico liderada pelo Lawrence Berkeley National Laboratory e apoiada pelo Departamento de Energia dos EUA sob o contrato no. DE-AC02-05CH11231, com esforços colaborativos, incluindo UC Berkeley e o Innovative Genomics Institute. Os co-autores do artigo incluem Nethery, o ex-pesquisador de pós-doutorado da NC State Claudio Hidalgo-Cantabrana e o estudante de pós-graduação da NC State Avery Roberts.
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