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A esclerose lateral amiotrófica (ALS), comumente conhecida como doença de Lou Gehrig e doença de Stephen Hawking, é uma doença neurodegenerativa que resulta na perda gradual de controle sobre os músculos do corpo. Atualmente é incurável e a causa da doença é desconhecida em mais de 90% de todos os casos – embora se acredite que fatores genéticos e ambientais estejam envolvidos.
Os grupos de pesquisa do Dr. Akira Kitamura na Faculdade de Ciências da Vida Avançada, Hokkaido University, e Prof. Jerker Widengren no KTH Royal Institute of Technology, Suécia, desenvolveram uma nova técnica que é capaz de detectar uma estrutura característica de RNA em tempo real em células vivas. A técnica, baseada na espectroscopia microscópica de fluorescência, foi publicada na revista Pesquisa de Ácidos Nucleicos.
“Um dos fatores genéticos que se acredita estar envolvido no desenvolvimento da ELA é uma sequência específica de RNA que forma uma estrutura de quatro cadeias, chamada G-quadruplex”, explica Kitamura, primeiro autor do estudo. “Normalmente, essas estruturas regulam a expressão de genes. No entanto, uma mutação no cromossomo 9 em humanos resulta na formação de G-quadruplexes que podem desempenhar um papel em doenças neurodegenerativas, incluindo ALS”.
Um dos maiores obstáculos para entender o papel exato dos G-quadruplexes na doença tem sido as limitações em estudar sua formação e localização dentro das células vivas em tempo real. Os grupos Kitamura e Widengren conseguiram desenvolver uma técnica simples, robusta e amplamente aplicável que resolve os problemas existentes.
A técnica rastreia um corante de cianina chamado Alexa Fluor 647 (AF647). Quando marcado para RNA, o estado piscante de fluorescência do corante é alterado com a formação dos quadriplexos G de RNA. Os grupos analisaram o RNA marcado com AF647 usando uma técnica de microscopia chamada monitoramento TRAST (TRAnsient STate) para detectar esse piscar de fluorescência em tempo real.
“Visualmente, as mudanças resolvidas no tempo na intensidade da fluorescência aparecem piscando”, disse Kitamura, descrevendo a técnica. “No TRAST, expomos as células a um padrão específico de mudança de intensidades de luz e medimos a intensidade média da fluorescência emitida pelo corante ligado ao RNA nas células em intervalos de tempo específicos. Ao medir as mudanças nas propriedades de piscar, podemos distinguir as estruturas de RNA dentro da célula.”
A equipe calibrou seu experimento em condições de laboratório, determinando exatamente qual piscada de fluorescência correspondia aos quadruplexes G de RNA. A partir desses dados, eles foram capazes de determinar a localização dos quadruplexes G de RNA dentro das células vivas usando o TRAST.
Este trabalho prova que os corantes de cianina podem fornecer parâmetros de leitura sensíveis nos estados de dobramento de quadruplexes G de RNA em células vivas e até mesmo para células individuais. Isso, por sua vez, permite estudar os quadruplexes do RNA G na doença em tempo real no nível intracelular. Também pode ser aplicado para estudar o dobramento e dobramento incorreto de proteínas nas células.
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