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Especialistas da Universidade de Barcelona, do Instituto de Química Avançada da Catalunha (IQAC-CSIC), do Instituto de Microeletrônica de Barcelona (IMB-CNM-CSIC) e do Instituto Aragão de Nanociência e Materiais de Aragão (INMA) — um instituto conjunto do CSIC e da Universidade de Zaragoza – desenvolveram um novo método para detectar vírus de RNA com base na tecnologia de sonda de formação de triplex. Essa metodologia inovadora abre novas opções para a detecção de vírus como o SARS-CoV-2, o vírus influenza A (H1N1) ou o vírus sincicial respiratório (RSV), patógeno que afeta recém-nascidos e requer um diagnóstico diferencial cuidadoso.
Este estudo interdisciplinar, publicado no Jornal Internacional de Ciências Moleculares, é dirigido por Carlos J. Ciudad e Verónica Noe, da Faculdade de Farmácia e Ciências Alimentares e do Instituto de Nanociência e Nanotecnologia (IN2UB) da Universidade de Barcelona; Ramón Eritja, Anna Aviñó, Lluïsa Vilaplana e M. Pilar Marco, do IQAC-CSIC e CIBER de Bioengenharia, Biomateriais e Nanomedicina (CIBER-BBN); Manuel Gutiérrez, Antoni Baldi e César Fernández, do IMB-CNM-CSIC, e Valeria Grazu e Jesús Martínez, pesquisadores do CSIC no Instituto de Nanociência e Materiais e Aragón INMA (CSIC-UNIZAR) e CIBER-BBN.
O estudo foi realizado no contexto do projeto PoC4CoV, liderado por M. Pilar Marco e César Fernández e financiado pela Plataforma Global de Saúde (PTI) do CSIC. O estudo de pesquisa continuou como parte de um projeto financiado por La Marató de TV3 2020 para lutar contra o COVID-19, no qual também participam especialistas da Faculdade de Química da UB.
Grampos de polipurina para capturar o RNA viral
A nova metodologia é baseada na capacidade de grampos de cabelo de polipurina (PPRHs) – projetados pelo grupo de terapia do câncer da UB – para capturar o RNA viral e formar um triplex de alta afinidade. Quando essa estrutura híbrida é conectada a uma sonda molecular e colocada em contato com a amostra do paciente afetado, obtém-se um sinal de detecção do agente viral. O método apresentado na publicação científica é chamado de Ensaio de Detecção de Ácido Nucleico Aprimorado Triplex (TENADA).
“PPRHs são grampos de cabelo de DNA de fita simples não modificados que consistem em dois domínios especulares de polipurinas antiparalelas. -DNA fita (ssDNA), DNA fita dupla (dsDNA) ou vírus de RNA via ligações Watson-Crick, formando um triplex antiparalelo”, diz o professor Carlos J. Ciudad, do Departamento de Bioquímica e Fisiologia da UB.
Uma metodologia eficaz e mais rápida que o teste de PCR
Uma vantagem na detecção do RNA viral é que a metodologia PPRH pode ser aplicada sem a intervenção da transcriptase reversa – enzima que converte o RNA em DNA – ou do termociclador (aparelho que amplifica amostras de material genético com a reação em cadeia da polimerase ou PCR). Além disso, possui sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste de PCR e pode fornecer resultados em menos de uma hora.
Como parte do estudo, a equipe usou a estratégia de hibridação sanduíche em vários dispositivos de biodetecção. Esta estratégia usa dois oligonucleotídeos: um hairpin de PPRH formador de triplex atuando como uma sonda de captura e um oligonucleotídeo de DNA formador de duplex marcado atuando como uma sonda de detecção.
“Os grampos PPRH formadores de triplex foram projetados para se ligar às sequências de polipirimidinas SARS-CoV-2, enquanto as sondas de detecção foram projetadas como complementares a uma região próxima ao local-alvo das polipirimidinas. Assim, a presença de SARS-CoV-2 O RNA é detectado pela formação do complexo ternário na superfície do biossensor”, diz a professora Verónica Noé (UB-IN2UB).
Essa metodologia foi implementada em um dispositivo eletroquímico compacto que integra uma célula eletroquímica de dois eletrodos em um chip — fabricado na Sala Limpa de Micro e Nanofabricação do IMB-CNM-CSIC — e um componente fluídico em papel, e em uma lateral térmica sistema de fluxo implementado em nitrocelulose e usando nanopartículas plasmônicas e papel térmico que foi desenvolvido no INMA (CSIC-UNIZAR).
TENADA: aplicações em pesquisa biomédica
Os PPRHs são descritos na literatura científica como ferramentas para o silenciamento de vários genes envolvidos principalmente no câncer. Além disso, também foram incorporados como sondas em biossensores para a detecção de pequenas moléculas de RNA (miRNA) para determinar o estado de metilação do DNA e para o diagnóstico de pneumonia causada pelo fungo Pneumocystis jirovecii.
Agora, a nova metodologia TENADA se mostra eficaz não apenas na detecção de partículas virais. A alta afinidade dos PPRHs pelo RNA viral é uma propriedade que pode ser aplicada para inibir o processo de replicação do vírus. Por esse motivo, as propriedades antivirais dos grampos de cabelo de polipurina CC1PPRH e CC2PPRH em células da linhagem VeroE6 infectadas com vírions SARS-CoV-2 também estão sendo estudadas.
Além disso, o trabalho realizado pelos diferentes grupos envolvidos também foi a base de uma tecnologia que foi patenteada e licenciada em julho de 2022 através da participação do UB Patent Centre, do CSIC e do CIBER-BBN. Além disso, esta patente foi licenciada de forma não exclusiva à empresa espanhola Nanoinmunotech através da gestão da Fundação Bosch i Gimpera (FBG-UB) no processo de proteção da tecnologia e do acordo de licenciamento da empresa.
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