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Observar tudo e qualquer coisa dentro do cérebro humano, não importa quão grande ou pequeno, enquanto ele está totalmente intacto, tem sido um sonho fora do alcance da neurociência há décadas, mas em um novo estudo em Ciência, uma equipe baseada no MIT descreve um pipeline de tecnologia que lhes permitiu processar com precisão, rotular ricamente e criar imagens nítidas de hemisférios completos dos cérebros de dois doadores – um com Alzheimer e outro sem – em alta resolução e velocidade.
“Realizamos imagens holísticas de tecidos cerebrais humanos em múltiplas resoluções, desde sinapses únicas até hemisférios cerebrais inteiros, e disponibilizamos esses dados”, disse o autor sênior e correspondente Kwanghun Chung, professor associado do Instituto Picower de Aprendizagem e Memória, dos Departamentos de Engenharia Química e Ciências do Cérebro e Cognitivas, e o Instituto de Engenharia Médica e Ciência do MIT. “Este pipeline de tecnologia realmente nos permite analisar o cérebro humano em múltiplas escalas. Potencialmente, esse pipeline pode ser usado para mapear completamente o cérebro humano.”
O novo estudo ainda não apresenta um mapa ou atlas abrangente de todo o cérebro, no qual cada célula, circuito e proteína é identificada e analisada, mas com imagens hemisféricas completas, demonstra um conjunto integrado de três tecnologias para permitir essa e outras soluções de longa duração. -procurou investigações em neurociências. A pesquisa fornece uma “prova de conceito”, mostrando numerosos exemplos do que o pipeline torna possível, incluindo paisagens abrangentes de milhares de neurônios em regiões cerebrais inteiras, diversas florestas de células, cada uma com detalhes individuais, e tufos de estruturas subcelulares aninhadas entre moléculas extracelulares. . Os pesquisadores também apresentam uma rica variedade de comparações analíticas quantitativas focadas em uma região escolhida nos hemisférios com e sem Alzheimer.
A importância de ser capaz de visualizar hemisférios inteiros do cérebro humano intactos e até a resolução de sinapses individuais (as minúsculas conexões que os neurônios forjam para formar circuitos) é dupla para a compreensão do cérebro humano na saúde e na doença, disse Chung.
Por um lado, permitirá aos cientistas realizar explorações integradas de questões utilizando o mesmo cérebro, em vez de terem de, por exemplo, observar fenómenos diferentes em cérebros diferentes, que podem variar significativamente, e depois tentar construir uma imagem composta do todo. sistema. Uma característica fundamental do novo pipeline tecnológico é que a análise não degrada o tecido. Pelo contrário, torna os tecidos extremamente duráveis e repetidamente re-rotuláveis para destacar diferentes células ou moléculas, conforme necessário para novos estudos, potencialmente durante anos a fio. No artigo, a equipe de Chung demonstra o uso de 20 rótulos de anticorpos diferentes para destacar diferentes células e proteínas, mas já estão expandindo isso para cem ou mais.
“Precisamos ser capazes de ver todos esses diferentes componentes funcionais – células, sua morfologia e sua conectividade, arquiteturas subcelulares e suas conexões sinápticas individuais – idealmente dentro do mesmo cérebro, considerando as altas variabilidades individuais no cérebro humano e considerando a natureza preciosa das amostras de cérebro humano”, disse Chung. “Este pipeline tecnológico realmente nos permite extrair todas essas características importantes do mesmo cérebro de uma forma totalmente integrada.”
Por outro lado, a escalabilidade e o rendimento relativamente elevados do pipeline (a obtenção de imagens de um hemisfério cerebral inteiro depois de preparado demora 100 horas em vez de muitos meses) significa que é possível criar muitas amostras para representar diferentes sexos, idades, estados de doença e outros fatores que podem permitir comparações robustas com maior poder estatístico. Chung disse que prevê a criação de um banco de cérebros com imagens completas que os pesquisadores possam analisar e reetiquetar conforme necessário para novos estudos, a fim de fazer mais comparações do tipo que ele e os coautores fizeram com os hemisférios com e sem Alzheimer no novo papel.
Três inovações principais
Chung disse que o maior desafio que enfrentou para alcançar os avanços descritos no artigo foi construir uma equipe no MIT que incluía três jovens cientistas especialmente talentosos, cada um co-autor principal do artigo devido aos seus papéis-chave na produção das três principais inovações. Ji Wang, engenheiro mecânico e ex-pós-doutorado, desenvolveu o “Megatome”, um dispositivo para cortar hemisférios cerebrais humanos intactos tão finamente que não há danos a ele. Juhyuk Park, engenheiro de materiais e ex-pós-doutorado, desenvolveu a química que torna cada fatia do cérebro clara, flexível, durável, expansível e rotulável de forma rápida, uniforme e repetida – uma tecnologia chamada “mELAST”. Webster Guan, um ex-aluno de graduação em engenharia química do MIT com talento para desenvolvimento de software, criou um sistema computacional chamado “UNSLICE” que pode reunificar perfeitamente as placas para reconstruir cada hemisfério em 3D completo, até o alinhamento preciso de vasos sanguíneos individuais e axônios neurais. (os longos fios que eles estendem para estabelecer conexões com outros neurônios).
Nenhuma tecnologia permite obter imagens de toda a anatomia do cérebro humano em resolução subcelular sem primeiro cortá-lo, porque é muito espesso (tem 3.000 vezes o volume do cérebro de um rato) e opaco. Mas no Megatome, o tecido permanece intacto porque Wang, que agora trabalha em uma empresa fundada por Chung chamada LifeCanvas Technologies, projetou sua lâmina para vibrar de um lado para o outro mais rápido e ainda assim fazer uma varredura mais ampla do que os cortadores vibratome anteriores. Enquanto isso, ela também criou o instrumento para permanecer perfeitamente dentro de seu plano, disse Chung. O resultado são fatias que não perdem informações anatômicas na separação ou em qualquer outro lugar. E como o vibratome corta de forma relativamente rápida e pode cortar placas de tecido mais espessas (e, portanto, menos), um hemisfério inteiro pode ser fatiado em um dia, em vez de meses.
Uma das principais razões pelas quais as lajes na tubulação podem ser mais espessas vem do mELAST. Park projetou o hidrogel que infunde a amostra do cérebro para torná-la opticamente clara, virtualmente indestrutível, compressível e expansível. Combinadas com outras tecnologias de engenharia química desenvolvidas nos últimos anos no laboratório de Chung, as amostras podem então ser infundidas de maneira uniforme e rápida com os rótulos de anticorpos que destacam células e proteínas de interesse. Usando um microscópio de folha de luz personalizado pelo laboratório, um hemisfério inteiro pode ser visualizado até sinapses individuais em cerca de 100 horas, relatam os autores no estudo. Park é agora professor assistente na Universidade Nacional de Seul, na Coreia do Sul. “Esta rede polimérica avançada, que ajusta as propriedades físico-químicas dos tecidos, permitiu imagens multiplexadas em múltiplas escalas dos cérebros humanos intactos”, disse Park.
Após a imagem de cada placa, a tarefa é restaurar computacionalmente uma imagem intacta de todo o hemisfério. O UNSLICE de Guan faz isso em múltiplas escalas. Por exemplo, na escala intermediária, ou “meso”, ele rastreia algoritmicamente os vasos sanguíneos que entram em uma camada a partir de camadas adjacentes e os combina. Mas também requer uma abordagem ainda mais refinada. Para registrar ainda mais as placas, a equipe rotulou propositalmente os axônios neurais vizinhos em cores diferentes (como os fios de uma instalação elétrica). Isso permitiu que o UNSLICE combinasse as camadas com base no rastreamento dos axônios, disse Chung. Guan também está agora no LifeCanvas.
No estudo, os pesquisadores apresentam uma série de exemplos do que o pipeline pode fazer. A primeira figura demonstra que a imagem permite rotular ricamente um hemisfério inteiro e, em seguida, ampliar desde a ampla escala de estruturas cerebrais até o nível dos circuitos, depois células individuais e depois componentes subcelulares, como sinapses. Outras imagens e vídeos demonstram quão diversificada pode ser a marcação, revelando longas conexões axonais e a abundância e forma de diferentes tipos de células, incluindo não apenas neurônios, mas também astrócitos e micróglia.
Explorando o Alzheimer
Durante anos, Chung colaborou com o coautor Matthew Frosch, pesquisador de Alzheimer e diretor do banco de cérebros do Hospital Geral de Massachusetts, para criar imagens e compreender cérebros com doença de Alzheimer. Com o novo pipeline estabelecido, eles iniciaram uma exploração aberta, notando primeiro onde, dentro de uma placa de tecido, observaram a maior perda de neurônios na amostra da doença em comparação com o controle. A partir daí, seguiram a sua curiosidade – tal como a tecnologia lhes permitiu fazer – produzindo finalmente uma série de investigações detalhadas descritas no artigo.
“Não definimos todos esses experimentos com antecedência”, disse Chung. “Começamos dizendo: ‘OK, vamos imaginar esta laje e ver o que vemos.’ Identificamos regiões cerebrais com perda neuronal substancial, então vamos ver o que está acontecendo lá. Então usamos muitos marcadores diferentes para caracterizar e ver as relações entre fatores patogênicos e diferentes tipos de células.
“Este gasoduto permite-nos ter acesso quase ilimitado ao tecido”, disse Chung. “Sempre podemos voltar e ver algo novo.”
Eles concentraram a maior parte de suas análises no córtex orbitofrontal de cada hemisfério. Uma das muitas observações que fizeram foi que a perda de sinapses estava concentrada em áreas onde havia sobreposição direta com placas amilóides. Fora das áreas de placas, a densidade de sinapses era tão alta no cérebro com Alzheimer quanto naquele sem a doença.
Com apenas duas amostras, disse Chung, a equipe não está oferecendo nenhuma conclusão sobre a natureza da doença de Alzheimer, é claro, mas o objetivo do estudo é que agora existe a capacidade de obter imagens completas e analisar profundamente hemisférios cerebrais humanos inteiros para permitir exatamente esse tipo de pesquisa.
Notavelmente, a tecnologia se aplica igualmente bem a muitos outros tecidos do corpo, não apenas ao cérebro.
“Prevemos que esta plataforma tecnológica escalável irá avançar a nossa compreensão das funções dos órgãos humanos e dos mecanismos das doenças para estimular o desenvolvimento de novas terapias”, concluem os autores.
Além de Park, Wang, Guan, Chung e Frosch, os outros autores do artigo são Lars A. Gjesteby, Dylan Pollack, Lee Kamentsky, Nicholas B. Evans, Jeff Stirman, Xinyi Gu, Chuanxi Zhao, Slayton Marx, Minyoung E. Kim , Seo Woo Choi, Michael Snyder, David Chavez, Clover Su-Arcaro, Yuxuan Tian, Chang Sin Park, Qiangge Zhang, Dae Hee Yun, Mira Moukheiber, Guoping Feng, X. William Yang, C. Dirk Keene, Patrick R. Hof , Satrajit S. Ghosh e Laura J. Brattain.
O principal financiamento para o trabalho veio dos Institutos Nacionais de Saúde, do Instituto Picower de Aprendizagem e Memória, da Fundação JPB e da Fundação Cultural NCSOFT.
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