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Em um desenvolvimento que pode acelerar a descoberta de novos diagnósticos e tratamentos, pesquisadores do Children’s Hospital of Philadelphia (CHOP) desenvolveram uma tecnologia versátil e de baixo custo para o sequenciamento direcionado de moléculas de RNA completas. A tecnologia, chamada TEQUILA-seq, é altamente econômica em comparação com as soluções comercialmente disponíveis para sequenciamento de RNA direcionado e pode ser adaptada para diferentes fins clínicos e de pesquisa. Os detalhes foram descritos em um artigo na Natureza Comunicações.
Na jornada do gene à proteína, uma molécula de RNA pode ser cortada e unida de diferentes maneiras antes de ser traduzida em uma proteína. Esse processo é conhecido como splicing alternativo e permite que um único gene codifique várias proteínas diferentes. Embora o splicing alternativo ocorra em muitos processos biológicos, ele pode ser desregulado em doenças como o câncer, levando a moléculas de RNA patogênicas. Para entender como o splicing alternativo pode levar à doença, os pesquisadores precisam ter uma contabilidade precisa de todas as moléculas de RNA (conhecidas como “isoformas de transcrição”) que emanam de um único gene.
Uma maneira de fazer isso é usar plataformas de sequenciamento de RNA de “leitura longa”, que sequenciam moléculas de RNA com mais de 10.000 bases de comprimento de ponta a ponta, capturando a totalidade das isoformas transcritas. No entanto, essas plataformas de leitura longa têm rendimento de sequenciamento modesto, o que dificultou sua adoção generalizada, especialmente no cenário clínico, pois gerar dados de sequenciamento de RNA de leitura longa em profundidade clinicamente informativa pode ser proibitivamente caro. O sequenciamento direcionado, que envolve o enriquecimento de sequências específicas de ácido nucleico de interesse antes do sequenciamento, é uma estratégia útil que pode aumentar substancialmente a cobertura de alvos predefinidos, mas o custo e a complexidade da captura do alvo têm sido barreiras para um uso mais amplo.
“O sequenciamento direcionado de RNA de leitura longa é uma estratégia poderosa para elucidar o repertório de RNA para qualquer conjunto predefinido de genes. No entanto, as tecnologias existentes para sequenciamento direcionado de moléculas de RNA de comprimento total são caras ou difíceis de configurar, colocando-as fora de alcance para muitos laboratórios”, disse o co-autor sênior Lan Lin, PhD, professor assistente de patologia e medicina laboratorial e membro do Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics no CHOP. “O TEQUILA-seq resolve esse problema por ser barato e fácil de usar. A tecnologia pode ser adaptada pelos usuários para diferentes finalidades, e os pesquisadores podem escolher quais genes querem sequenciar e fazer os reagentes para captura de alvos em seus próprios laboratórios. tem o potencial de acelerar a descoberta de novas soluções diagnósticas e terapêuticas para uma ampla gama de doenças.”
Um método que permite o sequenciamento direcionado é chamado de enriquecimento baseado em captura de hibridação, que usa pequenos pedaços de ácidos nucléicos chamados oligonucleotídeos como sondas de captura. Esses oligonucleotídeos (muitas vezes referidos simplesmente como “oligos”) são marcados com moléculas de biotina e projetados para hibridar com seus alvos com base na complementaridade da sequência de ácidos nucleicos, o que permite a fácil captura e isolamento de suas sequências alvo de uma amostra biológica. No entanto, embora o enriquecimento baseado em captura de hibridação seja um método eficiente para o sequenciamento direcionado, as sondas de captura biotiniladas sintetizadas comercialmente são caras e só podem ser usadas para um número limitado de reações, tornando o custo por amostra alto para cada reação de captura.
Para lidar com essa limitação, os pesquisadores do CHOP desenvolveram o TEQUILA-seq (enriquecimento de transcrição e quantificação utilizando sondas amplificadas isotermicamente lineares em conjunto com sequenciamento de leitura longa). Uma inovação importante no TEQUILA-seq é uma reação de amplificação de deslocamento de cadeia isotérmica desencadeada por nick-endonuclease, que pode sintetizar grandes quantidades de sondas de captura biotiniladas a partir de um pool barato de oligos não biotinilados como modelos. Usando uma entrada de apenas 2 ng de oligos modelo, os pesquisadores podem gerar 25 ug de sondas TEQUILA, que podem ser usadas para pelo menos 250 reações de captura. Essa estratégia inovadora para sintetizar sondas de captura torna o TEQUILA-seq altamente econômico e escalável para grandes painéis de alvo e muitas amostras biológicas.
Para avaliar seu desempenho, os pesquisadores realizaram o TEQUILA-seq para múltiplos painéis de genes em RNAs sintéticos ou humanos. As sondas TEQUILA tiveram um desempenho tão bom quanto as sondas de captura comerciais na captura e enriquecimento de alvos, sendo centenas de vezes mais baratas para cada reação de captura. Além disso, os pesquisadores demonstraram que TEQUILA-seq pode melhorar substancialmente a detecção, preservando a quantificação de moléculas de RNA alvo.
“Usando reagentes baratos e um fluxo de trabalho experimental fácil, o TEQUILA-seq nos permite sequenciar profundamente as moléculas de RNA de comprimento total para qualquer conjunto de genes em muitas amostras biológicas”, disse o co-autor sênior Yi Xing, PhD, diretor do Center for Computational and Medicina Genômica no CHOP. “Isso é muito empolgante e permite uma ampla gama de aplicações médicas, desde o diagnóstico genético guiado por RNA até o desenvolvimento de terapias”.
Para ilustrar sua utilidade biomédica, os pesquisadores aplicaram o TEQUILA-seq para traçar o perfil de moléculas de RNA completas de 468 genes de câncer acionáveis em 40 linhagens de células de câncer de mama. Eles descobriram isoformas de transcrição anteriormente desconhecidas em genes de câncer extensivamente estudados que podem lançar luz sobre como os genes que protegem o corpo do câncer são inativados em tumores individuais.
“Nosso trabalho mostra que o TEQUILA-seq pode ser amplamente utilizado para o sequenciamento direcionado de moléculas de RNA completas”, disse o Dr. Lin. “Além disso, as sondas TEQUILA são sondas de captura de uso geral. Elas são compatíveis com o sequenciamento de DNA e RNA direcionado, tanto em plataformas de sequenciamento de leitura longa quanto de leitura curta. A capacidade de gerar facilmente grandes quantidades de sondas de captura biotiniladas para qualquer painel de alvo a baixo custo e com facilidade pode facilitar estudos em larga escala e em nível populacional para muitas aplicações básicas, translacionais e clínicas.”
Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health (R01GM121827, R01GM088342, R56HG012310, U01CA233074, T32HG000046). A CHOP apresentou um pedido de patente para a tecnologia TEQUILA.
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