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Um grande desafio na genética humana é entender quais partes do genoma impulsionam características específicas ou contribuem para o risco de doenças. Esse desafio é ainda maior para variantes genéticas encontradas em 98% do genoma que não codificam proteínas.
Uma nova abordagem desenvolvida por pesquisadores da New York University e do New York Genome Center combina estudos de associação genética, edição de genes e sequenciamento de célula única para enfrentar esses desafios e descobrir variantes causais e mecanismos genéticos para características de células sanguíneas.
Sua abordagem, apelidada de STING-seq e publicada em Ciênciaaborda o desafio de conectar diretamente variantes genéticas a características e saúde humanas e pode ajudar os cientistas a identificar alvos de medicamentos para doenças com base genética.
Nas últimas duas décadas, os estudos de associação do genoma (GWAS) tornaram-se uma ferramenta importante para estudar o genoma humano. Usando o GWAS, os cientistas identificaram milhares de mutações genéticas ou variantes associadas a muitas doenças, da esquizofrenia ao diabetes, bem como características como a altura. Esses estudos são conduzidos comparando os genomas de grandes populações para encontrar variantes que ocorrem com mais frequência naqueles com uma doença ou característica específica.
O GWAS pode revelar quais regiões do genoma e possíveis variantes estão implicadas em doenças ou características. No entanto, essas associações são quase sempre encontradas nos 98% do genoma que não codificam proteínas, o que é muito menos compreendido do que os 2% bem estudados do genoma que codificam proteínas. Uma complicação adicional é que muitas variantes são encontradas próximas umas das outras dentro do genoma e viajam juntas por gerações, um conceito conhecido como ligação. Isso pode dificultar a separação de qual variante desempenha um papel verdadeiramente causal de outras variantes localizadas nas proximidades. Mesmo quando os cientistas podem identificar qual variante está causando uma doença ou característica, eles nem sempre sabem qual gene a variante afeta.
“Um dos principais objetivos do estudo de doenças humanas é identificar genes e variantes causais, que possam esclarecer os mecanismos biológicos e informar os alvos das drogas para essas doenças”, disse Neville Sanjana, professor associado de biologia na NYU, professor associado de neurociência e fisiologia na NYU Grossman School of Medicine, membro do corpo docente do New York Genome Center e co-autor sênior do estudo.
“O enorme sucesso do GWAS destacou o desafio de extrair informações sobre a biologia da doença a partir desses enormes conjuntos de dados. Apesar de todos os nossos esforços durante os últimos 10 anos, o copo ainda estava meio cheio – na melhor das hipóteses. Precisávamos de uma nova abordagem ”, disse Tuuli Lappalainen, membro sênior do corpo docente do New York Genome Center, professor de genômica no KTH Royal Institute of Technology, na Suécia, e co-autor sênior do estudo.
A cura para a anemia falciforme
Um recente avanço científico no tratamento da anemia falciforme – um distúrbio genético marcado por episódios de dor intensa – ilustra como a combinação do GWAS com ferramentas moleculares de ponta, como a edição de genes, pode identificar variantes causais e levar a terapias inovadoras. Usando o GWAS, os cientistas identificaram áreas do genoma importantes para a produção de hemoglobina fetal, um alvo baseado em sua promessa de reverter a anemia falciforme, mas não sabiam qual variante exata impulsiona sua produção.
Os pesquisadores recorreram ao CRISPR – uma ferramenta de edição de genes que usa “tesouras moleculares para cortar o DNA”, de acordo com Sanjana – para editar as regiões identificadas pelo GWAS. Quando as edições CRISPR foram feitas em um local específico no genoma não-codificante perto de um gene chamado BCL11Aresultou níveis elevados de hemoglobina fetal.
O CRISPR já foi usado em ensaios clínicos para editar essa região em células da medula óssea de dezenas de pacientes com anemia falciforme. Depois que as células modificadas são infundidas de volta nos pacientes, elas começam a produzir hemoglobina fetal, que desloca a forma adulta mutante da hemoglobina, curando-os efetivamente da doença falciforme.
“Esta história de sucesso no tratamento da doença falciforme é resultado da combinação de insights do GWAS com edição de genes”, disse Sanjana. “Mas foram necessários anos de pesquisa em apenas uma doença. Como podemos ampliar isso para identificar melhor as variantes causais e os genes-alvo do GWAS?”
GWAS atende CRISPR e sequenciamento de célula única
A equipe de pesquisa criou um fluxo de trabalho chamado STING-seq – Sistemático Targeting and Inhibition of Noncoding GWAS loci with single-cell sequencing. O STING-seq trabalha tomando o GWAS em escala de biobanco e procurando variantes causais prováveis usando uma combinação de marcadores bioquímicos e elementos regulatórios. Os pesquisadores então usam o CRISPR para atingir cada uma das regiões dos genomas implicados pelo GWAS e conduzem o sequenciamento de uma única célula para avaliar a expressão de genes e proteínas.
Em seu estudo, os pesquisadores ilustraram o uso de STING-seq para descobrir genes-alvo de variantes não codificantes para características sanguíneas. As características do sangue – como as porcentagens de plaquetas, glóbulos brancos e glóbulos vermelhos – são fáceis de medir em exames de sangue de rotina e foram bem estudadas no GWAS. Como resultado, os pesquisadores puderam usar o GWAS representando quase 750.000 pessoas de diversas origens para estudar características sanguíneas.
Depois que os pesquisadores identificaram 543 regiões candidatas do genoma que podem desempenhar um papel nas características do sangue, eles usaram uma versão do CRISPR chamada inibição de CRISPR, que pode silenciar regiões precisas do genoma.
Após o silenciamento do CRISPR das regiões identificadas pelo GWAS, os pesquisadores observaram a expressão de genes próximos em células individuais para ver se determinados genes foram ativados ou desativados. Se eles vissem uma diferença na expressão gênica entre as células onde as variantes foram e não silenciadas, eles poderiam vincular regiões não codificantes específicas a genes-alvo. Ao fazer isso, os pesquisadores puderam identificar quais regiões não codificantes são centrais para características específicas (e quais não são) e, muitas vezes, também os caminhos celulares pelos quais essas regiões não codificantes funcionam.
“O poder do STING-seq é que podemos aplicar essa abordagem a qualquer doença ou característica”, disse John Morris, um associado de pós-doutorado no New York Genome Center e na NYU e o primeiro autor do estudo.
Usar o STING-seq para testar grupos de variantes prováveis e ver seu impacto nos genes elimina as suposições que os cientistas encontraram anteriormente quando confrontados com a ligação entre variantes ou genes mais próximos de variantes, que muitas vezes, mas nem sempre, são o gene alvo. No caso de uma característica sanguínea chamada contagem de monócitos, a aplicação de CRISPR causou um gene, CD52para se destacar claramente como significativamente alterado – e enquanto CD52 estava perto da variante de interesse, não era o gene mais próximo, então pode ter sido ignorado usando métodos anteriores.
Em outra análise, os pesquisadores identificaram um gene chamado PTPRC que está associado a 10 características do sangue, incluindo aquelas relacionadas a glóbulos vermelhos e brancos e plaquetas. No entanto, existem várias variantes não codificantes identificadas por GWAS próximas e foi um desafio entender qual (se houver) poderia modular PTPRC expressão. A aplicação do STING-seq permitiu que eles isolassem quais variantes eram causais ao ver quais mudavam PTPRC expressão.
STING-seq e além
Embora o STING-seq possa identificar o gene alvo e a variante causal silenciando as variantes, isso não explica a direção do efeito – se uma variante não codificante específica aumentará ou reduzirá a expressão de um gene próximo. Os pesquisadores levaram sua abordagem um passo adiante para criar uma abordagem complementar que eles chamam de beeSTING-seq (edição de base STING-seq) que usa CRISPR para inserir com precisão uma variante genética em vez de apenas inibir essa região do genoma.
Os pesquisadores prevêem que STING-seq e beeSTING-seq sejam usados para identificar variantes causais para uma ampla gama de doenças que podem ser tratadas com edição de genes – como foi usado na anemia falciforme – ou com drogas que visam genes específicos ou células caminhos.
“Agora que podemos conectar variantes não codificantes a genes-alvo, isso nos dá evidências de que pequenas moléculas ou terapias de anticorpos podem ser desenvolvidas para alterar a expressão de genes específicos”, disse Lappalainen.
Outros autores do estudo incluem Christina Caragine, Zharko Daniloski, Lu Lu e Kyrie Davis, da NYU e do New York Genome Center; Júlia Domingo, Marcello Ziosi, Dafni Glinos, Stephanie Hao, Eleni P. Mimitou e Peter Smibert do New York Genome Center; Timothy Barry e Kathryn Roeder, da Carnegie Mellon University; e Eugene Katsevich da Universidade da Pensilvânia.
A pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde (DP2HG010099, R01CA279135, R01CA218668, R01AI176601, R01MH106842, UM1HG008901, R01GM122924, K99HG012792, R01MH123184), National Science Foundation (DMS- 2113072), o Canadian Institutes of Health Research, o European Molecular Biology Organization (ALTF 345-2021), American Heart Association (20POST35220040), Simons Foundation for Autism Research, MacMillan Center for the Study of the Non-Coding Cancer Genome, Wharton Data Science and Business Analytics Fund, New York University e o New York Genome Center.
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