.
CTCF é uma proteína crítica conhecida por desempenhar vários papéis em processos biológicos chave, como a transcrição. Cientistas do St. Jude Children’s Research Hospital usaram uma tecnologia de degradação de proteínas de última geração para estudar o CTCF. Seu trabalho revelou a superioridade da abordagem, além de fornecer informações funcionais sobre como o CTCF regula a transcrição. O estudo, publicado hoje na Biologia Genômicaabre caminho para estudos mais claros e diferenciados de CTCF.
A transcrição é um processo biológico essencial onde o DNA é copiado em RNA. O processo é a primeira etapa necessária em uma célula para receber as instruções alojadas no DNA e, finalmente, traduzir esse código em aminoácidos ou blocos de construção polipeptídicos que se tornam proteínas ativas. A transcrição desregulada desempenha um papel em muitos tipos de câncer pediátrico. Encontrar maneiras de modificar ou direcionar aspectos da maquinaria transcricional é uma nova fronteira na busca de vulnerabilidades que podem ser exploradas terapeuticamente.
Embora a biologia do CTCF tenha sido extensivamente estudada, ainda não está claro como os diferentes domínios (partes) do CTCF funcionam em relação à regulação da transcrição.
Uma das maneiras mais valiosas de estudar uma proteína é degradá-la ou removê-la de um sistema modelo. Na ausência da proteína, os pesquisadores podem estudar as mudanças funcionais que ocorrem, fornecendo informações sobre como a proteína influencia uma célula. Um sistema para degradar proteínas é o sistema degron 1 induzível por auxina (AID1). No entanto, esse sistema apresenta limitações na investigação da função do CTCF, como a alta dependência de dosagem de auxina, que causa toxicidade celular que atrapalha os resultados.
Cientistas do St. Jude aplicaram o sistema de segunda geração, degron induzível por auxina 2 (AID2) ao CTCF (o sistema foi desenvolvido por Masato Kanemaki, Ph.D., no Instituto Nacional de Genética). Este sistema é superior para estudos de perda de função, superando as limitações do sistema AID1 e eliminando os efeitos fora do alvo observados em abordagens anteriores.
“Abrimos a compreensão do impacto do CTCF usando um modelo de degradação, o sistema AID2”, disse o co-autor Chunliang Li, Ph.D., Departamento de Biologia de Células Tumorais de St. Jude. “Usando este sistema, identificamos as regras que regem a regulação da transcrição dependente de CTCF”.
“Quando a proteína CTCF se foi, nós e outros observamos que muito poucos genes mudam transcricionalmente”, disse Li. “Sabemos que quando removemos a maior parte da proteína CTCF nas células, o impacto na transcrição é mínimo. Portanto, a desconexão entre a depleção da proteína e a transcrição deve estar seguindo um mecanismo. Identificamos parte do mecanismo. na ligação ao DNA através do reconhecimento do motivo de ligação do DNA CTCF, mas também depende de certos domínios para se ligar a sequências específicas que flanqueiam o motivo. Para um subconjunto de genes, a transcrição é regulada apenas quando o CTCF se liga a essas sequências específicas.”
“Sistema de troca” lança luz sobre o papel dos domínios de dedo de zinco
Os pesquisadores combinaram o sistema AID2 com técnicas de ponta, como triagem SLAM-seq e sgRNA, para estudar como a degradação do CTCF altera a transcrição.
“Com a degradação, podemos criar um fundo muito limpo e, em seguida, introduzir um mutante. Essa troca acontece muito rápido, por isso o chamamos de sistema de troca rápida”, disse Li. “Esta é a primeira vez que um sistema limpo e de troca rápida foi usado para estudar mutantes individuais de CTCF.”
Por meio de seu trabalho, os cientistas identificaram o domínio do dedo de zinco (ZF) como a região do CTCF com maior relevância funcional, incluindo ZF1 e ZF10. A remoção de ZF1 e ZF10 do sistema modelo revelou regiões genômicas que requerem independentemente essas ZFs para ligar o DNA e regular a transcrição.
“O próprio CTCF é uma proteína multifuncional”, disse a co-primeira autora Judith Hyle, do Departamento de Biologia de Células Tumorais de St. Jude. “Ele tem várias funções em uma célula, desde a manutenção da arquitetura da cromatina até a regulação da transcrição, seja como ativador ou repressor da transcrição. Nosso interesse é como o CTCF está envolvido na regulação da transcrição e, com esse novo sistema, conseguimos degradar o CTCF muito mais rapidamente , e nos concentramos nos alvos específicos do CTCF. Fomos capazes de atribuir alguma função a esses dedos de zinco periféricos que não foram bem compreendidos, mostrando que certas regiões do genoma exigiam ou dependiam dessas ligações de dedos de zinco para regulação transcricional. Essa foi a primeira vez que isso foi visto ou confirmado em um sistema celular.”
Uma porta aberta para novas pesquisas
O sistema superior permitiu que os pesquisadores introduzissem mutações que pudessem ser rastreadas por meio de seu modelo. Os cientistas então conduziram estudos funcionais para entender as consequências de tais mutações em relação à ligação do CTCF e à regulação da transcrição.
Sobre a nova abordagem, o co-primeiro autor Mohamed Nadhir Djekidel, Ph.D., St. Jude Center for Applied Bioinformatics, disse “porque você pode obter dados limpos sobre os mutantes quando a proteína endógena é degradada, você pode realmente inferir o gene regulador rede, e isso abre as portas para diferentes análises downstream para entender como a regulamentação funciona.”
O estudo demonstra a superioridade do sistema AID2 para degradar proteínas e mostra a importância de estudar CTCF em um sistema claro. Esta é uma verificação importante para outros pesquisadores no campo da pesquisa de regulação transcricional. O trabalho também revelou novos caminhos para a pesquisa sobre esta proteína chave.
.
