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Uma terapia antisense desenvolvida por Joel D. Richter, PhD, Sneha Shah, PhD, e Jonathan K. Watts, PhD, na UMass Chan Medical School e Elizabeth Berry-Kravis, MD, PhD, no RUSH University Medical Center, restaura a produção do proteína FMRP em amostras de células retiradas de pacientes com síndrome do X frágil. Publicado no Anais da Academia Nacional de Ciênciasesse avanço foi possível por causa das novas descobertas, também apresentadas no estudo, de que o splicing alternativo aberrante do RNA mensageiro (mRNA) desempenha um papel principal na síndrome do X frágil, a forma mais comum de deficiência intelectual hereditária e o único causa genética do autismo.
“Esta descoberta oferece uma esperança real de que uma terapia para mitigar a síndrome do X frágil seja possível e possa ser traduzida para a clínica mais cedo do que pensávamos”, disse o Dr. Richter, o Cadeira Arthur F. Koskinas em Neurociência e professor de medicina molecular. “Essas descobertas não são convencionais e não eram algo que esperávamos. Se você fizer uma boa ciência básica, acreditar em seus dados e seguir aonde eles o levarem, os resultados podem mudar nossa compreensão fundamental da biologia e das doenças.”
A síndrome do X frágil é uma condição genética resultante de uma expansão da repetição CGG na sequência de DNA do gene do X frágil (FMR1). As pessoas com X frágil sofrem de deficiência intelectual, bem como de desafios comportamentais e de aprendizagem. As deficiências cognitivas podem variar de leves a graves e afetam os meninos com mais frequência do que as meninas. Não há cura para a síndrome do X frágil, embora intervenções como educação especial, fonoaudiologia, fisioterapia ou terapia comportamental e medicamentos que fornecem alívio sintomático possam oferecer a oportunidade de otimizar uma gama completa de habilidades.
Quando visto ao microscópio, o FMR1 O gene que contém a expansão repetida é detectado como uma banda estreita apertando a ponta de um braço do cromossomo X (identificado como o local frágil). A principal função do produto protéico do FMR1 O gene (FMRP) deve se ligar a até 1.000 mRNAs diferentes e inibir sua tradução. Quando o FMRP está ausente, como na síndrome do X frágil, há produção excessiva de centenas de proteínas diferentes no cérebro. Embora não seja totalmente compreendido como, o controle FMRP da tradução do mRNA desempenha um papel crítico na plasticidade sináptica e na função cerebral superior. Sem FMRP, o desenvolvimento neurológico normal não ocorre.
Normalmente, os humanos têm entre cinco e 55 repetições CGG no gene FMR1. A síndrome do X frágil ocorre quando um indivíduo tem mais de 200 repetições CGG na sequência do gene FMR1. O modelo convencional da doença sustenta que, uma vez que o comprimento da repetição CGG atinge 200 ou mais, o gene torna-se metilado e desligado, e não produz RNA FMR1 ou FMRP.
Utilizando amostras de sangue de homens com X frágil fornecidas pelo Dr. Berry-Kravis, professor de pediatria, ciências neurológicas e anatomia e biologia celular, os drs. Richter e Shah encontraram algo inesperado.
“Tínhamos motivos para acreditar que havia defeitos em vários mRNAs produzidos por pacientes com X frágil”, disse o Dr. Shah, professor assistente de medicina molecular. “Fizemos os experimentos e começamos a olhar para as várias leituras de RNA, no entanto, ficamos surpresos ao descobrir que as células estavam produzindo mRNA do X frágil, embora nenhuma proteína estivesse sendo produzida. Elas não deveriam estar produzindo nenhum mRNA do X frágil. Isso não deveria estar acontecendo. Isso nos fez repensar como a doença estava ocorrendo em um nível biológico básico.”
Olhando atentamente para o mRNA do X frágil portador da mutação, Shah encontrou uma isoforma de emenda anormal pouco conhecida, uma variação de sequência, conhecida como FMR1-217. Antes que o mRNA possa ser traduzido pelo ribossomo em uma proteína funcional, ele passa por um processo chamado splicing. Este processo intermediário remove todas as regiões não codificantes do RNA (íntrons) e une novamente as regiões codificadoras de proteínas (exons). Acredita-se que variações nesse mecanismo de splicing, chamado splicing alternativo, permitem que um único gene crie diferentes isoformas de RNA. Essas isoformas, porque cada uma contém diferentes regiões de codificação, permitem que um único gene produza várias proteínas.
As repetições CGG encontradas no FMR1 mutação genética, no entanto, estava causando um evento de splicing incorreto que deixou uma parte crucial de um íntron (um pseudo-exon) no mRNA maduro. Esse simples erro de splicing foi a razão pela qual o FMRP não estava sendo feito, não a metilação do gene, como se acreditava anteriormente. Richter e Shah levantaram a hipótese de que, se esse splicing incorreto pudesse ser corrigido ou evitado, a produção normal de proteína X frágil poderia ser restaurada.
Uma maneira de alterar o splicing do RNA é criar um oligonucleotídeo antisense (ASO), um pequeno pedaço de DNA com uma sequência complementar, que se ligará ao mRNA alvo. Essa ligação faz com que o maquinário de splicing pule os locais de splicing impróprios no RNA, resultando em splicing normal e formação de mRNA maduro. É também uma técnica que já está sendo empregada na clínica para tratar o distúrbio neuromuscular atrofia muscular espinhal (AME) e está em testes clínicos para outras doenças neurológicas.
Para projetar um ASO visando o frágil mRNA do X, Richter e seus colegas recorreram ao Dr. Watts, um especialista em ASO que também trabalha com doenças neurológicas, como a doença de Huntington e ALS. Watts, professor de terapêutica de RNA, projetou 11 ASOs na tentativa de encontrar um que bloqueasse o splicing incorreto do frágil X RNA e restaurasse a produção de FMRP. Uma combinação de dois ASOs desenvolvidos por Watts inibiu com sucesso o splicing aberrante e resgatou o splicing adequado do mRNA de FMR1 em células derivadas de pacientes. Isso levou à produção de níveis normais de FMRP nessas células.
“Nós nunca teríamos encontrado isso usando um modelo de mouse de X frágil”, disse Richter. “O modelo de camundongo é um nocaute de gene. Porque ele simplesmente não tem o gene X frágil, não há mRNA que é feito. O mis-splicing de mRNA FMR1 é um mecanismo de regulação de gene que depende da expansão CGG, que pode ser exclusivo de humanos e primatas. Só descobrimos esse erro de splicing porque estávamos trabalhando em células humanas.”
Richter e seus colegas esperam que a tradução dessa descoberta para a clínica possa ser acelerada porque os tratamentos atuais para SMA são baseados em uma tecnologia semelhante. A única diferença entre os dois é a sequência genética do ASO usado para tratar o splicing incorreto do X frágil.
“Esta é uma descoberta muito emocionante que tem alto potencial terapêutico”, disse Berry-Kravis. “É muito cedo no desenvolvimento, no entanto, e muito trabalho é necessário para determinar com que eficácia a estratégia ASO pode restaurar o FMRP, em que porcentagem de células cerebrais e em quais indivíduos com X frágil. Se a estratégia ASO for bem-sucedida em células de uma porcentagem significativa de indivíduos com X frágil, isso pode fornecer uma reversão genética da doença que pode ter alto impacto clínico e melhorar o nível funcional das pessoas que vivem com X frágil e reduzir a sobrecarga de seus cuidadores”.
O financiamento para a pesquisa foi fornecido, em parte, pelos Institutos Nacionais de Saúde, Fundação Simons para Pesquisa do Autismo, Fundação de Pesquisa FRAXA e Fundo UMass Chan BRIDGE. O próximo passo para a equipe do X frágil será garantir uma parceria com uma empresa comercial que possa ajudar a levar o trabalho da ASO a um eventual ensaio clínico humano para tratar a síndrome do X frágil.
“A FRAXA financiou os laboratórios Richter e Berry-Kravis para realizar um estudo inovador de eventos de splicing anormais no Fragile X com vistas ao uso potencial como um biomarcador”, disse Michael Tranfaglia, MD, diretor científico da FRAXA Research Foundation. “No decorrer desta pesquisa, esses excelentes cientistas descobriram por acaso algo verdadeiramente transformador que mudou nossa compreensão fundamental do próprio X frágil. Além disso, o potencial terapêutico dessa descoberta é verdadeiramente notável.”
Dr. Richter e seus colegas também receberam financiamento do BRIDGE Fund na UMass Chan em 2022 para projetar e testar o ASO usado para restaurar a produção de proteína X frágil.
“Com a ajuda de um prêmio do BRIDGE Fund, o laboratório do Dr. Richter demonstra que os oligonucleotídeos antisense bloqueiam eficientemente o splicing impróprio do FMR1 e restauram o FMRP aos níveis normais”, disse Huseyin Mehmet, PhD, diretor executivo de Inovação e Desenvolvimento de Negócios da BRIDGE na UMass Chan.
O próximo passo para a equipe do X frágil será garantir uma parceria com uma empresa comercial que possa ajudar a levar o trabalho da ASO a um eventual ensaio clínico em humanos para tratar a síndrome do X frágil.
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