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O tecido cerebral é um dos espécimes mais intrincados com os quais os cientistas provavelmente já lidaram. Embalado com uma quantidade atualmente imensurável de informações, o cérebro humano é o dispositivo computacional mais sofisticado com sua rede de cerca de 86 bilhões de neurônios. Compreender tal complexidade é uma tarefa difícil e, portanto, fazer progresso requer tecnologias para desvendar as minúsculas e complexas interações que ocorrem no cérebro em escalas microscópicas. A imagem é, portanto, uma ferramenta capacitadora em neurociência.
A nova tecnologia de imagem e reconstrução virtual desenvolvida pelo grupo de Johann Danzl no ISTA é um grande salto na geração de imagens da atividade cerebral e é apropriadamente chamada de LIONESS – Nanoscopia otimizada com informações ao vivo habilitando a segmentação saturada. O LIONESS é um canal para gerar imagens, reconstruir e analisar tecido cerebral vivo com abrangência e resolução espacial impossíveis até agora.
“Com o LIONESS, pela primeira vez, é possível obter uma reconstrução abrangente e densa do tecido cerebral vivo. Ao visualizar o tecido várias vezes, o LIONESS nos permite observar e medir a biologia celular dinâmica no cérebro em seu curso”, diz o primeiro autor Philipp Velicky. “O resultado é uma imagem reconstruída dos arranjos celulares em três dimensões, com o tempo formando a quarta dimensão, pois a amostra pode ser visualizada em minutos, horas ou dias”, acrescenta.
Com o LIONESS, os neurocientistas podem obter imagens de tecido cerebral vivo e obter imagens 3D de alta resolução sem danificar a amostra viva.
Colaboração e IA, a chave
A força do LIONESS está na ótica refinada e nos dois níveis de aprendizado profundo – um método de Inteligência Artificial – que compõem seu núcleo: o primeiro aprimora a qualidade da imagem e o segundo identifica as diferentes estruturas celulares no ambiente neuronal denso .
O pipeline resulta de uma colaboração entre o grupo Danzl, o grupo Bickel, o grupo Jonas, o grupo Novarino e as Unidades de Serviços Científicos da ISTA, bem como outros colaboradores internacionais. “Nossa abordagem foi reunir um grupo dinâmico de cientistas com conhecimentos combinados únicos além das fronteiras disciplinares, que trabalham juntos para fechar uma lacuna tecnológica na análise do tecido cerebral”, diz Johann Danzl, da ISTA.
Superando obstáculos
Anteriormente era possível obter reconstruções de tecido cerebral usando Microscopia Eletrônica. Esse método gera imagens da amostra com base em suas interações com os elétrons. Apesar de sua capacidade de capturar imagens com resolução de alguns nanômetros – um milionésimo de milímetro -, a Microscopia Eletrônica requer que uma amostra seja fixada em um estado biológico, que precisa ser seccionado fisicamente para obter informações 3D. Portanto, nenhuma informação dinâmica pode ser obtida.
Outra técnica previamente conhecida de Microscopia de Luz permite a observação de sistemas vivos e registra volumes de tecidos intactos cortando-os “opticamente” em vez de fisicamente. No entanto, a microscopia de luz é severamente prejudicada em seu poder de resolução pelas próprias propriedades das ondas de luz que usa para gerar uma imagem. Sua melhor resolução é de algumas centenas de nanômetros, muito granular para capturar detalhes celulares importantes no tecido cerebral.
Usando a microscopia de luz de super-resolução, os cientistas podem quebrar essa barreira de resolução. Trabalhos recentes neste campo, apelidados de SUSHI (Super-resolution Shadow Imaging), mostraram que a aplicação de moléculas de corante nos espaços ao redor das células e a aplicação da técnica de super-resolução vencedora do Prêmio Nobel STED (Stimulated Emission Depletion) microscopia revela ‘sombras super-resolvidas ‘ de todas as estruturas celulares e assim as visualiza no tecido. No entanto, tem sido impossível obter imagens de volumes inteiros de tecido cerebral com aprimoramento de resolução que corresponda à complexa arquitetura 3D do tecido cerebral. Isso ocorre porque o aumento da resolução também envolve uma alta carga de luz de imagem na amostra, o que pode danificar ou “fritar” o tecido vivo sutil.
Aqui reside a proeza do LIONESS, tendo sido desenvolvido para, segundo os autores, condições de imagem “rápidas e suaves”, mantendo assim a amostra viva. A técnica fornece super-resolução isotrópica – o que significa que é igualmente boa em todas as três dimensões espaciais – que permite a visualização dos componentes celulares do tecido em detalhes resolvidos em nanoescala 3D.
A LIONESS coleta apenas o mínimo de informações da amostra conforme necessário durante a etapa de geração de imagens. Isso é seguido pela primeira etapa de aprendizado profundo para preencher informações adicionais sobre a estrutura do tecido cerebral em um processo chamado Restauração de imagem. Desta forma inovadora, atinge uma resolução de cerca de 130 nanômetros, sendo suave o suficiente para a geração de imagens de tecido cerebral vivo em tempo real. Juntas, essas etapas permitem uma segunda etapa de aprendizado profundo, desta vez para entender os dados de imagem extremamente complexos e identificar as estruturas neuronais de maneira automatizada.
Homing In
“A abordagem interdisciplinar nos permitiu quebrar as limitações entrelaçadas na resolução de poder e exposição à luz para o sistema vivo, para entender os complexos dados 3D e combinar a arquitetura celular do tecido com medições moleculares e funcionais”, diz Danzl.
Para a reconstrução virtual, Danzl e Velicky se uniram a especialistas em computação visual: o grupo Bickel da ISTA e o grupo liderado por Hanspeter Pfister da Universidade de Harvard, que contribuíram com sua experiência em segmentação automatizada – o processo de reconhecer automaticamente as estruturas celulares no tecido — e visualização, com suporte adicional do cientista da equipe de análise de imagens da ISTA, Christoph Sommer. Para estratégias de rotulagem sofisticadas, neurocientistas e químicos de Edimburgo, Berlim e ISTA contribuíram. Consequentemente, foi possível fazer a ponte entre medições funcionais, ou seja, ler as estruturas celulares junto com a atividade de sinalização biológica no mesmo circuito neuronal vivo. Isso foi feito por imagens de fluxos de íons de cálcio nas células e medindo a atividade elétrica celular em colaboração com o grupo de Jonas no ISTA. O grupo Novarino contribuiu com organoides cerebrais humanos, muitas vezes apelidados de mini-cérebros que imitam o desenvolvimento do cérebro humano. Os autores destacam que tudo isso foi facilitado por meio do suporte especializado das unidades de serviços científicos de primeira linha da ISTA.
A estrutura e a atividade do cérebro são altamente dinâmicas; suas estruturas evoluem à medida que o cérebro executa e aprende novas tarefas. Esse aspecto do cérebro costuma ser chamado de “plasticidade”. Portanto, observar as mudanças na arquitetura do tecido cerebral é essencial para desvendar os segredos por trás de sua plasticidade. A nova ferramenta desenvolvida no ISTA mostra potencial para entender a arquitetura funcional do tecido cerebral e potencialmente de outros órgãos, revelando as estruturas subcelulares e capturando como elas podem mudar ao longo do tempo.
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